家蠶GMCβ2基因的克隆、表達(dá)及功能初探.pdf

1、GMC基因家族(glucose-methanol-cholinegenefamily)是指存在于生物有機(jī)體中的一大類以黃素腺嘌呤二核苷(FAD)為輔酶的氧化還原酶類基因,此基因家族所表達(dá)的蛋白含有同源的骨架結(jié)構(gòu),被命名為GMC氧化還原酶家族(glucose-methanol-cholineoxidoreductasefamily)。這類基因最初在微生物中發(fā)現(xiàn),大量存在于昆蟲和脊椎動(dòng)物中,但在線蟲和高等的脊椎動(dòng)物中很少或沒有發(fā)現(xiàn)此類基因。

2、GMC氧化還原酶功能各異,可催化不同的反應(yīng),現(xiàn)在至少可以劃分出11種功能,然而關(guān)于GMC基因家族的具體基因功能研究還不是很多。
　　 Iida(2007)的研究發(fā)現(xiàn),昆蟲基因組中含有大量的GMC基因家族基因,在昆蟲中,此類基因家族的大多數(shù)基因成簇的串聯(lián)排布在高度保守的GMC基因簇中,這個(gè)基因簇包含在一個(gè)很大的內(nèi)含子flotillin-2內(nèi)。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物,其遺傳學(xué)、生理生化、病理學(xué)的研究已有大量報(bào)道,尤其家蠶基因組

3、學(xué)研究在近十年來更是長(zhǎng)足發(fā)展,但家蠶GMC基因家族的研究卻幾乎還是個(gè)空白。通過分析,我們發(fā)現(xiàn)家蠶中存在43個(gè)GMC氧化還原酶類基因,而且它們?cè)诩倚Q基因組中的分布情況與Iida研究中的昆蟲相一致。
　　 本研究是在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上,選取了家蠶GMC基因家族中的一個(gè)基因-BmGMCβ2作為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行克隆、表達(dá)及功能初探,經(jīng)以上研究鑒定該基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、BmGMCβ2基因的克隆及序列分

4、析
　　 基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)計(jì)引物并克隆了目的基因BmGMCβ2。通過生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn),BrnGMCβ2基因全長(zhǎng)1875bp,編碼624個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為69.3kD,等電點(diǎn)(pI)為6.21。該基因位于家蠶16號(hào)染色體的scaf3058上,含GMC基因家族所共有的ADP-Bindingβ-α-β折疊結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明,該基因是家蠶GMC基因家族β亞家族成員。
　　 2、BmGMCβ2基因的表達(dá)

5、特征分析
　　 利用RT-PCR技術(shù)分析BmGMCβ2基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,BmGMCβ2基因在家蠶5齡盛食期表達(dá)量較高。在組織層面上,BmGMCβ2基因主要是在表皮、脂肪體和氣管中表達(dá),且此基因的轉(zhuǎn)錄在組織分布上沒有性別差異。
　　 3、BmGMCβ2基因的原核表達(dá)和多克隆抗體制備
　　 將擴(kuò)增好的帶有特定酶切位點(diǎn)的BmGMCβ2基因片段酶切后,亞克隆到表達(dá)載體pET-28a(+

6、)中,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),在69kD左右出現(xiàn)一條與預(yù)測(cè)蛋白大小相一致的較濃條帶,確定其為目的蛋白。目的蛋白經(jīng)His-層析純化柱純化后制備多克隆抗體。然后用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)原核表達(dá)的目的蛋白,在69kD左右處出現(xiàn)特異的雜交信號(hào),說明制備的抗體具有良好的特異性,可用于下一步研究。
　　 4、GMCβ2蛋白在家蠶中的組織定位
　　 利用Wester

7、nblotting技術(shù)檢測(cè)GMCβ2蛋白在家蠶各組織中的分布情況,結(jié)果顯示,該蛋白主要在家蠶脂肪體中表達(dá)。然后我們還通過免疫組化的方法,在脂肪體組織中探測(cè)到了雜交信號(hào),證實(shí)了該基因在家蠶脂肪體組織中的蛋白表達(dá)情況。
　　 5、BmGMCβ2基因的功能初探
　　 用病原微生物G-菌(沙雷氏菌,S.aureus)、G+菌(黑胸?cái)⊙?B.beauveria)和真菌(白僵菌,B.bassiana)添食家蠶后,利用熒光定量PCR