A類(lèi)清道夫受體胞漿域結(jié)合多肽的功能研究.pdf

1、心血管疾病是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，也是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一。而動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是局部缺血發(fā)作，冠心病等心血管疾病的主要病理生理原因。因此AS已成為心血管疾病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)領(lǐng)域。巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生的早期及斑塊破裂等各個(gè)階段都起著重要的作用。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞被認(rèn)為是“治療AS的靶點(diǎn)"。A類(lèi)清道夫受體(scavenger receptor A，SR-A)是一種主要位于巨噬細(xì)胞膜表面的同源三聚體糖蛋白，能夠介導(dǎo)乙?；兔芏?/p>

2、脂蛋白(AcLDL)等配體不受負(fù)反饋調(diào)節(jié)地進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。研究認(rèn)為，SR-A的胞漿結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的脂質(zhì)內(nèi)吞、細(xì)胞黏附以及受體在細(xì)胞表面的表達(dá)等過(guò)程。去除SR-A胞漿域的受體可以在細(xì)胞中表達(dá)并能結(jié)合乙?；兔芏戎鞍?AcLDL)，但不能介導(dǎo)AcLDL進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。因此，推測(cè)SR-A的胞漿域可能是干預(yù)泡沫細(xì)胞形成的重要靶點(diǎn)。王曉花等人在前期實(shí)驗(yàn)中利用SR-A的胞漿域?yàn)榘悬c(diǎn)篩選噬菌體多肽庫(kù)，篩選出與其相

3、互作用的小分子多肽H11。研究發(fā)現(xiàn)多肽H11可以抑制SR-A介導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的結(jié)合及內(nèi)吞。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上探討多肽H11對(duì)SR-A功能如對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響，并且對(duì)其分子作用機(jī)制做進(jìn)一步研究。 為了進(jìn)一步研究多肽H11對(duì)SR-A介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成的影響，我們用人工法合成多肽H11，并在其氨基端融合一穿膜肽TAT(RKKRRQRRR)，使得多肽H11可以進(jìn)入細(xì)胞并與SR-A胞漿域相結(jié)合。用佛波酯(phorbo

4、l ester)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，使之分化為巨噬細(xì)胞并在細(xì)胞表面大量表達(dá)SR-A。用多肽TAT-H11處理細(xì)胞30min后，再加入高濃度的AcLDL，以誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成。72h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未加入多肽的細(xì)胞組相比，加入了多肽FAT-H11的細(xì)胞組其油紅染色區(qū)占整個(gè)細(xì)胞面積的比例減少了20％。此結(jié)果說(shuō)明多肽TAT-H11能明顯抑制THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的泡沫細(xì)胞形成。在形態(tài)學(xué)上觀(guān)察多肽TAT-H11對(duì)THP-1巨噬細(xì)

5、胞的脂質(zhì)積聚影響后，我們進(jìn)一步檢測(cè)了多肽。TAT-H11對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯積聚的影響。在用AcLDL負(fù)荷細(xì)胞后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入多肽后，細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇酯含量減少約17％，游離膽固醇含量無(wú)顯著性差異，而膽固醇酯含量減少了約36％。此結(jié)果表明多肽H11對(duì)于游離膽固醇的抑制并不明顯，它主要抑制了膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)的積聚。泡沫細(xì)胞的形成主要是由于細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的積聚引起的。因此我們可以得出結(jié)論，多肽可以抑制膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)的

6、積聚，泡沫細(xì)胞的形成受到抑制。為了解多肽H11對(duì)SR-A其它功能的可能影響，我們進(jìn)一步檢測(cè)了多肽對(duì)SR-A在THP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響。在對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)之前，加入多肽TAT-H11使其進(jìn)入細(xì)胞30min后，再加入PMA促使細(xì)胞分化表達(dá)SR-A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)多肽TAT-H11存在時(shí)SR-A的蛋白表達(dá)受到抑制。且隨著加入多肽濃度的增加，SR-A蛋白表達(dá)抑制程度越大。當(dāng)多肽濃度達(dá)到10μM時(shí)，SR-A的表達(dá)被抑制了40％.為了進(jìn)一步分

7、析多肽對(duì)SR-A蛋白表達(dá)的抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平還是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平，我們用RT-PCR法檢測(cè)多肽對(duì)SR-A的mRNA表達(dá)是否有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多肽存在時(shí)，SR-A的mRNA表達(dá)被抑制了.說(shuō)明了多肽對(duì)SR-A表達(dá)的影響是在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生的。SR-A在與多肽TAT-H11結(jié)合以后減少了對(duì)AcLDL攝取，膽固醇酯的積聚減少，泡沫細(xì)胞的形成受到抑制。其中的機(jī)制可能是多肽在與SR-A結(jié)合后影響了SR-A介導(dǎo)的某條下游信號(hào)通路，從而影響了SR-

8、A對(duì)脂質(zhì)的攝取。有文獻(xiàn)報(bào)道信號(hào)分子JNK2磷酸化的抑制可以減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。因此，我們加入配基AcLDL刺激THP-1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)SR-A介導(dǎo)的下游信號(hào)通路的發(fā)生，并用Western Blot法檢測(cè)多肽TAT-H11對(duì)信號(hào)分子JNK MAPK以及其它信號(hào)分子如ERK/P38 MAPK磷酸化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽H11對(duì)JNK2的磷酸化有抑制作用，對(duì)其他信號(hào)分子的磷酸化則無(wú)影響。表明多肽對(duì)SR-A介導(dǎo)的脂質(zhì)內(nèi)吞的抑制可能是通過(guò)對(duì)