運用GLGI技術鑒定白念珠菌LongSAGE標簽.pdf

1、白念珠菌是一種重要的條件性致病真菌，在各種真菌感染中占了首位。感染人的粘膜表面可引起鵝口瘡、念珠菌性陰道炎疾?。辉谙到y(tǒng)性疾病的病人和免疫缺陷的人群中，白念珠菌可以引起全身的播散性感染并導致死亡。白念珠菌的毒力因子和發(fā)病機理有關，主要包括促進白念珠菌粘附于宿主細胞的生物分子(黏附素)，與侵入有關的酶SAP(分泌型天冬氨酸蛋白酶)和PL(磷脂酶)，及其菌相轉換(生長狀態(tài)，可逆的單個酵母細胞和菌絲的轉換)。并且，菌相轉換和抗原表達的改變有關。

2、 為更全面的尋找白念珠菌酵母相和菌絲相致病相關基因及其毒力因子，本實驗室前期應用LongSAGE技術，通過構建白念珠菌酵母相和菌絲相細胞LongSAGE標簽庫，來定性定量檢測白念珠菌酵母相和菌絲相細胞表達基因的改變，并聚類分析表達基因功能，探討酵母相和菌絲相細胞表達基因與菌相轉換、菌株毒力的相關性。 為了驗證LongSAGE標簽，我們利用SAGE標簽產生長片段cDNA應用于基因識別技術(generationoflonge

3、rfragmentsfromserialanalysisofgeneespression(SAGE)tagsforgeneidentificationGLGI)，將17bp的SAGE標簽向3’端擴增到數百bp。17bp的LongSAGE標簽作為正向引物，3’端使用的是單一堿基dA、dC或dG與oligo-dT結合的引物進行第1次PCR擴增，只有與LongSAGE標簽相匹配的序列才能退火并得以擴增；在第2次循環(huán)中，只有5’端oligo-d

4、A的前一堿基與錨定的oligo-dT相匹配的序列才能擴增，而單純的oligo-dA與oligo-dT結合的片段因處于錨定狀態(tài)則受抑制，因而最終得到的是含有LongSAGE標簽的長片段DNA擴增產物，產物長度在200～1000bp之間。 GLGI技術提供了幾種潛在的結果。首先，它為LongSAGE技術提供了發(fā)展策略；其次，結合應用LongSAGE-GLGI技術可以作為人或其它物種的基因的選擇和表達；再次，它可以鑒定任何基因的3’端

5、序列的外顯子；最后，結合應用LongSAGE-GLGI技術可以確定人或其它物種的3’端在基因家族中所表達基因。 20個多重匹配標簽中有15個獲得穩(wěn)定有效的擴增，長度在200～1000bp之間，獲得的長片段進行序列分析后，有超過95％的堿基與已知基因相同，并且包括原來17bp的SAGE標簽，表明獲得的序列為此已知基因。其中酵母相多重匹配標簽17是基因PHR1(AF247190)的部分序列，是一個表達受pH值調控的基因，該基因的敲除

6、白念珠菌在pH為7的條件下不能形成菌絲。菌絲相多重匹配標簽10是AF051313即基因ALS8的部分序列；酵母相多重匹配標簽13是U87956即基因ALS3的部分序列；酵母相多重匹配標簽11為AF068866即基因ALS5的部分序列。其余獲得擴增的LongSAGE標簽與白念珠菌結構蛋白相關。如酵母相多重匹配標簽15和與AY497754(18SrRNA的基因)部分序列相同；菌絲相多重匹配的標簽9和L28817(5.8SrRNA)的基因部分

7、序列相同；菌絲相多重匹配3和X70659(25SrRNA的基因)的部分序列相同。 20個LongSAGE文庫的無匹配標簽中有6個獲得穩(wěn)定有效的擴增，其中4個進行了測序。經過生物信息學分析，獲得部分序列的信息。①菌絲無匹配標簽50經擴增后獲得的序列經過生物信息學分析后與XM70995(即白念珠菌的推測胞質核糖體蛋白質的DNA)有88％堿基序列重復；②菌絲相無匹配標簽56經擴增后獲得的序列分析與X70659(即白念珠菌的25SrRN

8、A的基因)有82％堿基序列重復；③酵母無匹配標簽36經過擴增后獲得的序列分析與X81697(即白念珠菌乙醇脫氫酶的DNA)有76％堿基序列重復；④酵母無匹配標簽51擴增獲得的序列和XM708755有81％堿基序列重復，其在白念珠菌中為一種蛋白質的DNA序列，但這種蛋白質的功能是未知的。 研究表明，用SAGE標簽作為引物，可有效地識別基因。LongSAGE-GLGI技術可以用來說明更多的白念珠菌的表達基因序列和其它真核生物的基因組