孕中期弓形蟲感染致孕鼠及胎鼠毒性作用的探討.pdf

1、本文研究目的：弓形蟲是一種專性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，孕期弓形蟲感染可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等不良妊娠結(jié)局，嚴(yán)重影響人類的優(yōu)生優(yōu)育。以往的研究主要集中在孕婦弓形蟲感染對(duì)胎兒毒性作用的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)調(diào)查方面，而其致不良妊娠機(jī)制方面的研究，國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立孕中期弓形蟲感染的孕鼠模型，研究(1)弓形蟲感染對(duì)胎鼠的生長發(fā)育及體內(nèi)微量元素的影響；(2)弓形蟲感染對(duì)胎盤組織細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因bax、bcl-2表達(dá)的影響；(3)弓形蟲感染對(duì)

2、孕鼠血清中孕酮、雌三醇含量的影響；(4)弓形蟲感染對(duì)孕鼠血紅系列及血清鐵蛋白含量的影響；初步探討孕中期弓形蟲感染對(duì)孕鼠及胎鼠的毒性作用。 研究方法：取9～10周齡的BALB/c處女鼠，體重22±1g，與雄鼠合籠。在孕8天，檢出孕鼠160只，隨機(jī)分為染蟲組(100只)和正常對(duì)照組(60只)。染蟲組經(jīng)腹腔接種純化的RH株弓形蟲速殖子(100個(gè)/0.2ml/只)；正常對(duì)照組注射等量0.01MPBS(pH7.3)。于孕10、12、14、

3、16、18天分別處死染蟲組孕鼠20只，正常對(duì)照組12只。(1)每組1/2的孕鼠經(jīng)摘眼球取血，分離血清，采用放射免疫法檢測孕鼠血清中孕酮(P)、雌三醇(E<,3>)、鐵蛋白(Ferr)含量；(2)其余1/2的孕鼠取全血，抗凝處理，進(jìn)行血紅系列分析；(3)全部孕鼠剖腹，剝離胎鼠，記錄胚胎總數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)；測量胎鼠的身長、尾長；采用原子吸收分光光度法檢測胎鼠體內(nèi)微量元素Zn、Cu、Fe的含量；采用比色法測定胎鼠體內(nèi)總蛋白含量；胎鼠經(jīng)Bou

4、in’s液固定，切片，作3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)增強(qiáng)的Perl’s鐵染色，觀察胎鼠整體切片、胎肝、胎腦組織中鐵的分布；(4)剝離孕鼠胎盤，一部分胎盤作組織壓片，姬瑞氏染色，觀察胎盤中蟲體的感染情況；其余胎盤經(jīng)Bouin's液固定、切片，一部分切片經(jīng)HE染色，觀察其病理變化；一部分切片經(jīng)DNA缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測胎盤組織細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)；其余切片采用免疫組織化學(xué)染色法檢測胎盤組織弓形蟲抗原、細(xì)胞凋

5、亡調(diào)控基因bax和bcl-2的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：(1)觀察胎鼠一般狀況，發(fā)現(xiàn)在孕14、16、18天，染蟲組的胚胎總數(shù)、活胎數(shù)、胎鼠的平均體重與正常對(duì)照組相比均明顯減少(P<0.05)。染蟲組胎鼠平均身長、尾長在孕14天時(shí)雖有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而孕16、18天時(shí)均明顯下降(P<0.05)。(2)胎鼠體內(nèi)微量元素Zn、Cu、Fe的含量測定顯示，染蟲組胎鼠Zn含量在孕12～18天均低于正常組(P<0.05)；C

6、u含量在孕10、12、14天均與正常組無差異，而在孕16、18天均低于對(duì)照組(P<0.05)：Fe含量在孕12～18天均低于正常組(P<0.05)，其中孕12、14天時(shí)下降的最顯著(P<0.01)。(3)胎鼠組織切片鐵染色呈棕黃色顆粒，染蟲組胎鼠整體切片、胎肝及胎腦鐵染色強(qiáng)度與正常組相比均明顯減弱。 (4)胎鼠體內(nèi)總蛋白含量測定顯示，染蟲組孕14天胎鼠總蛋白含量與對(duì)照組無差別(P>0.05)，而孕16、18天均明顯減少(P<0.01)。

7、(5)隨著感染時(shí)間的延長，染蟲組胎盤組織中的蟲體逐漸增多，切片HE染色可見絨毛有炎性病變：有的細(xì)胞縮小、胞漿濃縮，可見凋亡小體形成。 (6)經(jīng)TUNEL證實(shí)，染蟲組和對(duì)照組孕鼠胎盤組織中均可見凋亡細(xì)胞存在，且隨著妊娠期的延長而增加。在孕14、16、18天，染蟲組的細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。(7)免疫組化顯示，染蟲組孕鼠胎盤組織的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中可見弓形蟲抗原的表達(dá)；Bax隨妊娠天數(shù)的增加在胎盤絨毛和蛻膜組織中表

8、達(dá)增強(qiáng)；而Bcl-2主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)層，表達(dá)量隨著妊娠期逐漸減弱。在孕晚期，染蟲組Bax表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。 (8)放射免疫測定顯示，在孕10、12、14天，染蟲組孕鼠血清中P、E<,3>含量與對(duì)照組無差別(P>0.05)；而在孕16、18天時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。(9)孕鼠血紅系列分析顯示：①染蟲組與對(duì)照組

9、孕鼠的全血紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(HGB)含量、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)均無差別(P>0.05)。②染蟲組孕鼠的紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)與對(duì)照組相比有輕微增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。③染蟲組孕鼠紅細(xì)胞平均體積(MCV)在孕10、14天與對(duì)照組比較無差別(P>0.05)，在孕12天減小(P<0.05)，在孕16、18天顯著減小(P<0.01)。④染蟲組孕鼠紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)

10、在孕10、12天與對(duì)照組比較無差別(P>0.05)，而在孕14、16、18天明顯降低(P<0.01)。(10)放射免疫測定顯示，染蟲組孕鼠血清鐵蛋白含量在孕10、12、14天輕微降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：而在孕16、18天顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。 研究結(jié)論：(1)孕中期弓形蟲感染不僅可引起胚胎總數(shù)和活胎數(shù)減少、胎鼠平均體重減輕、身長及尾長縮短，而且可引起胎鼠總蛋白及微量元素Zn、Cu、Fe含量下降，表明孕中期

11、弓形蟲感染可引起胚胎營養(yǎng)不良和發(fā)育障礙。 (2)孕中期弓形蟲感染可引起胎盤組織炎性病變；可引起絨毛組織中bax過度表達(dá)，bcl-2表達(dá)減少，二者比例失衡可誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加。炎性病變及凋亡的增加可降低胎盤的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及內(nèi)分泌的功能，影響胚胎生長發(fā)育，是弓形蟲感染致孕鼠生殖毒性和胚胎發(fā)育毒性的病理基礎(chǔ)。(3)孕中期弓形蟲感染可引起孕鼠血清中P、E<,3>含量下降，既可能是弓形蟲感染致胚胎發(fā)育遲緩、胎盤組織炎性病變及滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加的結(jié)