晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病在2型糖尿病患者中的發(fā)生率和死亡率均明顯增高，2型糖尿病患者是發(fā)生心腦血管疾病的高危人群。2型糖尿病發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的易患因素包括高血糖、脂代謝紊亂、高血壓等，但是往往在良好的血糖、血脂、血壓控制的情況下仍然發(fā)生大血管病變。2型糖尿病患者體內(nèi)存在氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，增強(qiáng)的氧化應(yīng)激從內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、血管炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和易脆性、前血栓狀態(tài)的促進(jìn)等多個(gè)病理生理學(xué)方面加速大血管病變的進(jìn)展。

2、 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）是Witko-sarsat于1996年首次從尿毒癥患者血漿中發(fā)現(xiàn)的一種尿毒癥毒素，主要是血清白蛋白的酪氨酸殘基被活化的中性粒細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶產(chǎn)生的次氯酸氧化形成的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物。AOPP是敏感而精確的氧化應(yīng)激標(biāo)志物，又可加重氧化應(yīng)激，是潛在的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物，同時(shí)促進(jìn)炎癥的發(fā)展，起到炎癥介質(zhì)的作用。很多實(shí)驗(yàn)表明AOPP與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，但是，AOPP促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制還不明確。 本研究擬

3、探討AOPP對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響，對(duì)SDF-1α趨化單核細(xì)胞的作用，以及對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響，同時(shí)探討這一作用是否通過(guò)MAPK徑路轉(zhuǎn)導(dǎo)，最后從臨床角度觀察2型糖尿病患者血漿AOPP水平及其與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系。 方法： 一、ECV304細(xì)胞株及THP-1細(xì)胞株的培養(yǎng):兩種細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5%CO2濕潤(rùn)的恒溫孵箱中。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640

4、。取第3-5代用于實(shí)驗(yàn)，以臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，各組細(xì)胞死亡率均≤5%。 二、AOPP-BSA的制備:200mg/ml BSA與0．2mol/L NaOCl各取等量混合（即以1：60摩爾比混合），室溫孵育30分鐘，4℃以0．01mol/L PBS（pH7．4）透析24小時(shí)，0．22μm硝酸纖維素膜過(guò)濾消毒，-70℃凍存。以經(jīng)同樣處理但未加NaOCl的BSA作對(duì)照。酸性條件340nm測(cè)AOPP-BSA濃度，以氯胺-T為標(biāo)準(zhǔn)品

5、，實(shí)際測(cè)定的為AOPP對(duì)氯胺-T的相對(duì)濃度。 三、THP-1/ECV304細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn):將ECV304細(xì)胞接種于6孔板，加入不同濃度AOPP，之后再加入THP-1細(xì)胞37℃孵育30分鐘，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野粘附的THP-1細(xì)胞數(shù)。 四、SDF-1α趨化THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn):單核細(xì)胞遷移用8μM孔徑的Transwell小室來(lái)分析。不同濃度AOPP預(yù)處理24小時(shí)的THP-1細(xì)胞加到上室，下室加入不同濃度的SDF-1α，37

6、℃孵育10小時(shí)后取出上室，在300×顯微鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)4個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取其平均值。 五、SDF-1α mRNA的測(cè)定:ECV304細(xì)胞分別與細(xì)胞培養(yǎng)基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/lAOPP-BSA共同孵育6小時(shí)，或者與200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小時(shí)后，收集細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR法測(cè)定SDF-1α mRNA的表達(dá)。 六

7、、SDF-1α蛋白的測(cè)定:ECV304細(xì)胞分別與細(xì)胞培養(yǎng)基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/lAOPP-BSA共同孵育12小時(shí)，或者與200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot法測(cè)定SDF-1α蛋白的表達(dá)。阻斷實(shí)驗(yàn)中先以不同濃度的p38MAPK特異性阻斷劑SB203580或者ERK1/2特異性阻斷劑U0126與ECV304孵育1小

8、時(shí)，然后與200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小時(shí)，ELISA法測(cè)定上清液中SDF-1α蛋白濃度。 七、p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的測(cè)定:ECV304細(xì)胞分別與細(xì)胞培養(yǎng)基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/lAOPP-BSA共同孵育15分鐘，或者與200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、15、30、60、120分鐘后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot法測(cè)

9、定p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。 八、2型糖尿病患者血清SDF-1α及AOPP濃度測(cè)定:清晨空腹抽取靜脈血5ml加入含10% EDTA的抗凝管中，離心取上清。SDF-1α濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用熒光免疫分析儀檢測(cè)每孔在450nm處的吸光度。AOPP濃度應(yīng)用分光光度法測(cè)定，血清與PBS按1：5稀釋?zhuān)月劝?T同法稀釋作空白對(duì)照，加入1．16mmol/L KI10μl及乙酸20μ1后立刻測(cè)340

10、nm處的吸收度值。 結(jié)果： 一、AOPP呈劑量依賴(lài)性的方式促進(jìn)THP-1細(xì)胞與ECV304細(xì)胞的粘附未經(jīng)AOPP處理時(shí)粘附于ECV304的THP-1細(xì)胞甚少，50μmol/l的AOPP就可使粘附的THP-1細(xì)胞數(shù)目明顯增加，以200μmol/l的AOPP組所粘附的細(xì)胞數(shù)目最多，與對(duì)照組相比較增加了約26倍。 二、AOPP呈劑量依賴(lài)性的方式增強(qiáng)SDF-1α對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用 將不同濃度AOPP處理2

11、4小時(shí)后的THP-1細(xì)胞用10ng/ml SDF-1α進(jìn)行趨化。隨著AOPP濃度的增加，被趨化的細(xì)胞數(shù)也逐漸增加，200μmol/l AOPP組所趨化的細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的11倍。 三、AOPP呈時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)增加 與200μmol/L AOPP-BSA孵育2小時(shí)后ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)量較對(duì)照組既顯著增加，6小時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降，24小時(shí)SDF-1

12、α mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。與50μmol/l，100μmol/l，200μmol/L AOPP-BSA孵育6小時(shí)后ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)量依次升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。200μmol/L BSA孵育或者未加處理因素者也有SDF-1α mRNA的表達(dá)，兩組間無(wú)差異。 四、AOPP呈時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α蛋白合成增多 與200μmol/L AOPP-

13、BSA孵育2小時(shí)后SDF-1α蛋白合成量較對(duì)照組顯著增加，隨時(shí)間的推移蛋白合成量逐漸增加，24小時(shí)合成量最多。與50μmol/l，100μmol/l，200μmol/L AOPP-BSA孵育24小時(shí)后ECV304細(xì)胞SDF-1α蛋白合成量依次增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與200μmol/L BSA孵育或者未加處理因素者也有SDF-1α蛋白的合成，兩組間無(wú)差異。 五、AOPP呈時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)ECV304細(xì)胞p-p

14、38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成增多 與200μmol/L AOPP-BSA孵育15分鐘后p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量較對(duì)照組顯著增加，之后逐漸下降，120分鐘仍處于較高水平。 與50μmol/l，100μmol/l，200μmol/L AOPP-BSA孵育15分鐘后ECV304細(xì)胞p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量依次增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 六、 p38MAPK

15、特異性阻斷劑SB203580或者ERK1/2特異性阻斷劑U0126均可呈劑量依賴(lài)方式阻斷AOPP對(duì)ECV304細(xì)胞SDF-1α蛋白合成的促進(jìn)作用 0．1μM的SB203580或者U0126均可明顯抑制AOPP-BSA對(duì)SDF-1α蛋白合成的促進(jìn)作用，隨著阻斷劑濃度的增加，抑制率逐漸升高，10μM阻斷劑的抑制率最高。 七、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高，血清AOPP水平與多種心血管危險(xiǎn)因素相關(guān) 與

16、正常對(duì)照組相比，2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平顯著升高。2型糖尿病患者中血糖控制良好組血清AOPP水平高于血糖控制不良組，胰島素抵抗（IR）組血清AOPP水平高于非胰島素抵抗（non-IR）組，有大血管并發(fā)癥組血清AOPP水平明顯高于無(wú)大血管并發(fā)癥組。2型糖尿病患者中高AOPP組體重指數(shù)（BMI），空腹血糖（FPG），糖化血紅蛋白（GHbAlc），甘油三酯（TG）及SDF-1α水平明顯高于正常AOPP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、。 結(jié)論： 一、AOPP呈劑量依賴(lài)方式促進(jìn)ECV304細(xì)胞與THP-1細(xì)胞間的粘附，同時(shí)增強(qiáng)SDF-1α對(duì)THP-1細(xì)胞的趨化作用。 二、AOPP呈時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)及蛋白合成增加。 三、AOPP促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α蛋白合成增加是通過(guò)p38MAPK及ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 四、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高，血清AO