不同代謝狀態(tài)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，動(dòng)脈內(nèi)膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)增加及血栓形成等多種病理改變貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的全過(guò)程。糖尿病人群由于動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生冠心病、缺血性或出血性腦血管病，肢端壞疽等并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群，并且具有高度致殘、致死性。 近來(lái)，學(xué)者們對(duì)各種細(xì)胞因子在AS的發(fā)生、發(fā)展了大量研究，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelia

2、lgrowthfactor，VEGF)以其重要作用，備受注目。VEGF是目前已知最強(qiáng)最主要的誘導(dǎo)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子。VEGF是最強(qiáng)的血管生成因子，它通過(guò)和血管內(nèi)皮的特異性受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促內(nèi)皮增強(qiáng)，促血管生成作用。研究表明，VEGF在AS的形成中起著重要的作用。Chen等應(yīng)用原位免疫組織化學(xué)方法研究證實(shí)，在AS斑塊中，平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中都有VEGF的強(qiáng)表達(dá)，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與內(nèi)膜血管化程度呈正相關(guān)，且VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的分

3、布與新生血管的分布高度一致，即主要位于斑塊肩部與纖維帽部位。除缺氧外，幾乎所有參于AS發(fā)生發(fā)展的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子都能上調(diào)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，VEGF是目前已知最強(qiáng)最主要的誘導(dǎo)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子，并能誘導(dǎo)其它促進(jìn)血管發(fā)生的細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)及表達(dá)VEGF受體的單核細(xì)胞的遷移，這在AS的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的意義。 研究證實(shí)糖尿病患者體內(nèi)有高水平的葡萄糖、糖基化終產(chǎn)物(advancedglcatio

4、nendproducts，AGEs)和游離脂肪酸(freefattyacid，F(xiàn)FA)，其確切機(jī)制未明。糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是生物胺與還原糖在無(wú)酶條件下經(jīng)復(fù)雜的重排、脫水及縮合而成的不可逆的共價(jià)產(chǎn)物。游離脂肪酸(FFA)是血脂的重要組成部分，軟脂酸(palmitate，PA)是游離脂肪酸的主要組成部分。 本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，

5、采用原位雜交和Westernblot方法從葡萄糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白表達(dá)的影響角度探討葡萄糖在糖尿病AS中的作用，以期為臨床防治AS提供新的思路和途徑。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304用RMPI1640+10％56℃滅活的新生牛血清，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，隔天換液。將傳代的ECV304內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)在1×108/L，每孔2ml接種于預(yù)先放置有滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)

6、板中培養(yǎng)，每隔一天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓24小時(shí)，然后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 2.原位雜交將培養(yǎng)于蓋玻片的各組內(nèi)皮細(xì)胞用0.1MPBS(PH7.4)洗2min×3次。4％多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000DEPC，室溫固定20分鐘。蒸餾水充分洗滌。新鮮配制0.5％H2O2/甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋

7、的胃蛋白酶(1ml3％檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，于室溫消化60秒。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。后固定：1％多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000DEPC，室溫固定10分鐘。蒸餾水洗滌3次。預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備—干的雜交盒底部加20％甘油20ml以保持溫度。按每張切片20μl加預(yù)雜交液，恒溫箱37℃4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。雜交：按每張切片20μl雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻

8、片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱37℃雜交過(guò)夜。雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，30-37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；0.5×SSC洗滌15分鐘×1次；0.2×SSC洗滌15分鐘×1次。滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分鐘。原位雜交用PBS洗滌5分鐘×4次。滴加SABC：37℃20分鐘。原位雜交用PBS洗滌5分鐘×3次。滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃20分鐘。原位雜交用PBS洗滌

9、5分鐘×4次。DAB顯色：使用顯色試劑盒-1ml蒸餾水加顯色劑A，B，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上，鏡下觀察顯色充分后再不是充分水洗。蘇木素復(fù)染，充分水洗。酒精脫水，二甲苯透明，封片。鏡下觀察，并采用MetaMorphimagingsystemDP10/13X51型細(xì)胞圖像分析儀進(jìn)行VEG-FmRNA的半定量分析。陰性對(duì)照用預(yù)雜交液替代探針工作液。 3.Westernblot樣品制備：內(nèi)皮細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，于不同時(shí)間點(diǎn)

10、收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞懸于500μl冰冷緩沖液，冰浴中將細(xì)胞超聲粉碎，4℃12000rpm/min離心1h，棄沉淀。定蛋白：吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定樣本中蛋白濃度，然后將每個(gè)樣品中蛋白濃度調(diào)至相同。樣品中加入樣品緩沖液，沸水煮5min。電泳：每個(gè)樣品取50μl于15％SDS-PAGE分離4h，BIO-RAD電泳板，雙板條件為：150v，30mA。轉(zhuǎn)?。合跛崂w維素膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10min，然后遵循膠在負(fù)極，膜在正極

11、的原則，經(jīng)1h的轉(zhuǎn)印(電壓：2mv/cm2)后TFBS洗膜3次，每次5min。封閉：用含5％BSA的TBS室溫封閉2小時(shí)。一抗孵育：分別與兔抗VEGF(1：300)，GAPDH(1：500)4℃孵育過(guò)夜。二抗孵育：分別與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：500)室溫孵育2小時(shí)。檢測(cè)：用堿性磷酸酶法顯影，采用GDS8000型電泳凝膠成像分析儀照像并定量。用各樣品與其內(nèi)參照GAPDH的比值代表其蛋白的相對(duì)水平。 結(jié)果： 1.

12、不同濃度葡萄糖(5.6mmol/L-22.2mmol/L)孵育10d后隨著葡萄糖濃度增加VEGFmRNA的表達(dá)逐漸增高，22.2mmol/L時(shí)表達(dá)最高；各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為6.17±1.32、10.89±1.74、16.57±1.36和21.46±2.13(p＜0.05)；各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)量分別為5.6mmol/L葡萄糖組的1.37倍、1.84倍和2.64倍(P＜0.05)。同一濃度(2

13、2.2mmol/L)葡萄糖孵育0d、5d、10d及15d后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為5.48±1.21、11.23±1.67、21.46±2.13和28.64±3.12(p＜0.05)；各組VEGF蛋白的表達(dá)量分別為0d組的1.82倍、3.13倍及4.07倍(p＜0.05)。葡萄糖可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，且與濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。 2.對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF呈弱表達(dá)；1

14、00mg/L、200mg/L及400mg/LAGEs孵育24h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為11.37±1.40、15.61±2.05和23.25±1.72(BSA對(duì)照組為7.16±1.58，p＜0.05)；400mg/LAGEs分別孵育12、24、及36h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為14.64±1.83、23.25±1.72和35.89±2.21(0h組為6.32±1.51

15、，p＜0.05)。100mg/L、200mg/L及400mg/LAGEs孵育24h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.41倍、1.96倍和2.55倍(p＜0.05)；400mg/LAGEs分別孵育12、24、及36h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA蛋白的表達(dá)量分別為0h組的1.91倍、2.82倍和3.47倍(p＜0.05)。AGEs可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，且與濃度和時(shí)間呈依賴性。 3

16、.100μmol/L、200μmol/L及300μmol/LPA孵育24h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為12.79±2.03、17.58±1.65和22.03±1.81(0μmol/LPA組為6.84±1.52，p＜0.05)；300μmol/LPA分別孵育12、24、及36h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)的平均積分光密度值分別為15.22±1.76、22.03±1.81和31.24±2.37(0h組

17、為7.13±1.34，p＜0.05)。100μmol/L、200μmol/L及300μmol/LPA孵育24h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)量分別為0μmol/LPA組的1.52倍、2.07倍和3.24倍(p＜0.05)；300μmol/LPA分別孵育12h、24h、及36h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA蛋白的表達(dá)量分別為0h組的1.72倍、2.63倍和3.51倍(p＜0.05)。軟脂酸可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白

18、的表達(dá)，且呈濃度和時(shí)間依賴性。 結(jié)論： 1.葡萄糖可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，且與濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。葡萄糖可能對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化具有促進(jìn)作用。 2.AGEs可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，且與濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。AGEs可能對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化具有促進(jìn)作用。3.軟脂酸可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，且呈濃度和時(shí)間依賴性。游離脂肪酸可能對(duì)糖尿病動(dòng)脈