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文檔簡介
1、目的:
建立無標(biāo)記探針分子診斷技術(shù)檢測基因SNP。
方法:
采用新型熒光染料建立無標(biāo)記探針分子診斷技術(shù)進(jìn)行基因的SNP分型。設(shè)計IL-1B基因-511T>C、-31T>C、3954C>T和IL-6基因-174G>C、-597G>A以及IL-6R基因外顯子358A>C等SNP位點的擴(kuò)增引物和無標(biāo)記探針。以其中IL-6基因-597G>A位點為例,按PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性進(jìn)行不同染料Mg2+濃度、
2、DNA聚合酶、不對稱PCR引物比例、模板濃度以及退火溫度等擴(kuò)增條件的優(yōu)化。并以此優(yōu)化體系為基礎(chǔ)建立各位點聚合酶鏈反應(yīng)-無標(biāo)記探針(PCR-UP)技術(shù)分子診斷方法,同時用所建立的擴(kuò)增體系對100例臨床標(biāo)本進(jìn)行IL-6基因-597G>A和-174G>C位點的基因分型,分型后的雜合型和突變型PCR產(chǎn)物以測序金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗證。
結(jié)果:
結(jié)果顯示EvaGreen熒光PCR檢測體系最適Mg2+濃度為2.5 mmol/L,金
3、思特realstartTaq DNA polymerase擴(kuò)增效率和PCR產(chǎn)物特異性最佳,模板最低濃度可達(dá)10ng/10μL;IL-1B基因-511T>C、-31T>C、3954C>T的引物不對稱比例為0.02/0.3umol/L,IL-6基因-174G>C和-597G>A位點的引物比例為0.1/0.5 umol/L,IL-6R基因外顯子358A>C位點不對稱PCR引物比例為0.05/0.5/μmol/L時PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性最好
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