利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)汞及單核苷酸多態(tài)性.pdf

1、核酸是重要的生命大分子，核酸的分析在生命科學(xué)研究中具有重要的意義。核酸特殊序列及單核苷酸多態(tài)性（SNP）的檢測(cè)，在臨床診斷、病理分析等方面都有很重要的作用。汞污染是一個(gè)世界性問(wèn)題，對(duì)人類健康造成重要影響。滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)是新近發(fā)展起來(lái)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度和特異性好的特點(diǎn)，對(duì)核酸及單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)具有廣泛的應(yīng)用前景。本論文主要應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合分子熒光檢測(cè)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)SNP和汞的新方法。<

2、br>　　 1、結(jié)合靈敏度高、特異性強(qiáng)的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，建立了一種均相檢測(cè)SNP的新方法。設(shè)計(jì)掛鎖式DNA 探針，其3’,5’端與突變型DNA 完全匹配。
　　 以突變型DNA 為模板使掛鎖式DNA 探針特異性連接成環(huán)，然后以突變型DNA作引物進(jìn)行RCA反應(yīng)。同時(shí)，在RCA反應(yīng)過(guò)程中，加入熒光標(biāo)記的dGTP，使其結(jié)合到新合成的DNA鏈上，利用陽(yáng)離子共軛聚合物（CCP）與DNA 之間強(qiáng)烈的靜電作用，在CCP和

3、結(jié)合到DNA鏈上的熒光分子之間發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。而野生型DNA 與掛鎖式探針有錯(cuò)配堿基，不能使其連接成環(huán)，不能形成RCA反應(yīng)。根據(jù)二者熒光信號(hào)的顯著差異可實(shí)現(xiàn)突變型DNA高靈敏度和特異性的檢測(cè)，可精確測(cè)定1％的突變。
　　 2、設(shè)計(jì)含有9個(gè)堿基的環(huán)形DNA 探針，基于汞離子可以特異性連接T-T堿基，即形成T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)一段含有9個(gè)T堿基序列的引物，它能與含有多個(gè)T堿基的環(huán)形探針在汞離子的作用下