HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷SiHa細胞SCID鼠的免疫功能的影響及宮頸癌發(fā)生過程中免疫逃逸機制的研究.pdf

1、宮頸癌的發(fā)生率為婦科惡性腫瘤之首，死亡率居婦科惡性腫瘤第二位。目前對宮頸癌的治療包括放療、手術、化療等，但仍有大量的患者復發(fā)而死亡，而對那些復發(fā)病例的治療效果相對較差，因此，需要尋求新的治療手段。大量流行病學調查發(fā)現宮頸癌與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染密切相關，并以HPV16最為常見。HPVE6和E7持續(xù)表達于宮頸癌細胞，具有免疫原性，是免疫治療理想的靶抗原。與活的或重組疫苗比較，多肽疫苗可特異地直接針對免疫系統(tǒng)的特異免疫表位。多肽疫苗

2、安全，相對易于臨床生產，對較少的免疫表位誘發(fā)特異的免疫應答，疫苗治療的在于提高針對E6和E7病毒蛋白的細胞免疫反應，從而清除HPV感染的細胞。但目前尚不能體外培養(yǎng)HPV，而且HPV具有嚴格的種族特異性，限制了HPV動物模型的使用。以細胞和體液嚴重聯合免疫缺陷為特征SCID鼠的發(fā)現，在SCID鼠體內人免疫功能重建的成功，實現了在動物體內研究人類免疫細胞和人類腫瘤的關系。 雖然有跡象表明在免疫抑制的患者中，宮頸腫瘤的發(fā)生率明顯增高，

3、但是HPV相關腫瘤發(fā)病過程中免疫應答所起的作用并不清楚。盡管已有多種宮頸癌HPV疫苗研發(fā)的報道，其中部分已進入臨床驗證，但從現有資料來看，大多療效不盡如人意。究其原因與腫瘤細胞逃逸宿主免疫監(jiān)視有密切關系。這種免疫逃逸是由于腫瘤細胞所行使的防御機制和/或宿主免疫系統(tǒng)功能受損，可以歸納為兩種機制即腫瘤細胞的被動免疫逃逸和腫瘤細胞的主動攻擊。 腫瘤細胞被動免疫逃逸的機制主要為腫瘤細胞缺乏共刺激分子和低表達MHC分子。MHC-Ⅰ類分子在

4、腫瘤細胞的免疫識別和效應過程中起著重要作用。CD99可調節(jié)MHC-Ⅰ類分子從高爾基體轉運至細胞表面的表達。HLA-G是一種非經典的HLA-Ⅰ類抗原，可能是腫瘤免疫逃逸的機制之一。目前對MHC-Ⅱ類分子異常表達的生理和病理學意義還不清楚。 腫瘤細胞的主動攻擊是指腫瘤細胞可以通過對自身表面分子的表達的改變來逃避機體的免疫監(jiān)視，使機體的全身免疫功能及局部免疫功能受到抑制。腫瘤細胞表達FasL，與Fas結合，可誘導淋巴細胞進入凋亡，被認

5、為與人類腫瘤的“免疫反擊”。 為此，我們以接種SiHa細胞株(表達HPV16)的人免疫重建SCID鼠為研究對象，在國內外首次建立免疫重建荷人HPV16陽性宮頸癌SCID鼠模型，繼以HPV16E7多肽疫苗輔以T輔助細胞免疫表位，乳化于IFA中接種于SCID鼠，觀察其生物學特性及其對免疫功能的影響；并研究宮頸癌發(fā)生過程中免疫調節(jié)分子HLA-DR、CD99和HLA-G所起的作用，了解被動免疫逃逸機制在宮頸癌發(fā)生中的作用；通過檢測Fas

6、、FasL和c-FLIP在正常宮頸、CIN和宮頸鱗癌中的表達，了解Fas/FasL途徑在宮頸癌發(fā)生中作用，旨在提高HPV疫苗的臨床療效。 第一部分HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷人宮頸癌細胞株SiHa細胞SCID鼠免疫功能的影響目的觀察HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷人宮頸癌細胞株SiHa細胞嚴重聯合免疫缺陷(SCID)鼠移植瘤的影響。方法對SCID鼠腹腔注射人外周血淋巴細胞(PBL)后24小時，皮下接種HPV16陽性的

7、人宮頸癌細胞株SiHa細胞，建立人免疫重建荷SiHa細胞的SCID鼠模型，當移植瘤最小體積達100mm3時，三次背部皮下接種疫苗，每次接種間隔二周，觀察荷瘤鼠一般生物學特性，檢測血漿中人IgG含量、外周血中人CD3+、CD4+、CD8+T細胞、脾重、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)以及脾細胞毒殺傷功能。實驗設立空白組，僅為腹腔內注射PBL，疫苗成份僅為不完全佐劑(IFA)；隨機多肽組，為腹腔內注射PBL，皮下接種SiHa細胞，疫苗成份僅為隨機

8、多肽+T輔助多肽+IFA；T輔助多肽組，為腹腔內注射PBL，皮下接種SiHa細胞，疫苗成份僅為T輔助多肽+IFA；多肽治療組，為腹腔內注射PBL，皮下接種SiHa細胞，疫苗成份為HPV16E711-20(YMLDLQPETT)，HPV16E7s6-93(TLGIVCPI)+T輔助多肽+IFA。結果各組SCID鼠血漿中人IgG水平，8周內隨重建時間延長而升高(P＜0.05)，多肽治療組達2957.85μg/ml，但各組間無顯著性差異；外周

9、血中均可檢測到人CD3+、CD4+、CD8+T細胞，但各組間無顯著性差異(P＞0.05)；與空白組比較，其他三組SCID鼠脾重均顯著增加(P＜0.05)。組織學觀察到移植瘤局部TIL浸潤及明顯的出血和壞死，但經免疫組化未檢測到人CD8+T細胞。與空白組比較，多肽治療組、隨機多肽組、輔助多肽組的脾細胞毒殺傷功能均顯著降低(P＜0.05)。結論人免疫功能重建的荷SiHa細胞的SCID鼠體內重建的人免疫功能隨荷瘤時間的延長受到抑制，多肽疫苗在

10、一定程度上能減輕免疫抑制狀態(tài)。 第二部分子宮頸癌發(fā)生過程中被動免疫逃逸機制的研究目的研究宮頸癌發(fā)生過程中細胞膜分子HLA-DR、HLA-G和CD99的作用。方法應用特異性抗體HLA-DR、HLA-G和CD99，用免疫組化方法檢測19例正常宮頸組織、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宮頸鱗癌中HLA-DR、HLA-G和CD99蛋白的表達，并檢測Ki67的表達情況。結果在正常宮頸和CIN中，除了3例CINⅢ外，均不

11、表達HLA-DR，在宮頸鱗癌組織中，中分化和低分化鱗癌HLA-DR的表達顯著高于高分化鱗癌(P＜0.05)。所有正常宮頸標本均呈HLA-G強表達，陽性顆粒位于宮頸鱗狀上皮和宮頸管內的柱狀上皮。只有小部分CINs和SCCs表達HLA-G，與正常對照組比較，CINs和SCCs中HLA-G的表達顯著降低(P＜0.001)。SCCs中CD99的表達顯著高于正常宮頸組織(P＜0.01)和CINs(P＜0.05)。所有標本均可見Ki67陽性染色細胞

12、。在SCCs和CINs中，Ki67的表達顯著高于正常對照組(P＜0.001)，但SCCs和CINs間Ki67的表達無顯著性差異。結論HLA-DR和CD99表達增高可能與宮頸癌的發(fā)生有關。 第三部分子宮頸癌發(fā)生過程中主動免疫攻擊機制的研究目的檢測凋亡相關抗原Fas、FasL和cFLIP在宮頸癌細胞的表達方式，研究Fas介導的凋亡在宮頸癌發(fā)生中的作用。方法應用特異性抗體Fas、FasL和cFLIP，用免疫組化方法檢測19例正常宮頸組

13、織、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宮頸鱗癌中Fas、FasL和cFLIP蛋白的表達，并用TUNEL檢測所有標本中凋亡指數。結果在CINⅠ、CINⅡ和正常宮頸，Fas的表達無顯著性差異；在宮頸中分化鱗癌中，Fas的表達高于CINⅢ和宮頸高分化鱗癌，而宮頸低分化鱗癌中，Fas的表達低于宮頸中分化鱗癌，但均未達到顯著性差異。在CINs中幾乎不表達FasL，但隨著腫瘤分化程度的下降，FasL的表達顯著增加。從正常宮頸→C

14、INs→宮頸癌，cFLIP的表達逐漸增高，并隨分化程度的下降，cFLIP的表達呈增高趨勢，但不同分化程度間的表達，差異無顯著性。從正常宮頸到宮頸鱗癌，凋亡指數呈下降趨勢(p＜0.05)。在SCCs中行各指標間的相關性分析，發(fā)現Fas的表達與cFLIP呈正相關(r=0.423，p=0.000)，而cFLIP的表達與凋亡指數呈負相關(r=-0.499，p=0.000)。結論Fas/FasL系統(tǒng)調節(jié)異常和宮頸鱗癌中cFLIP的表達增加，可能是