人骨髓間充質干細胞軟骨分化相關性microRNA的篩選.pdf

1、目的：通過檢測人骨髓間充質干細胞（BMSCs）及其誘導分化的軟骨細胞中miRNA基因的表達譜，篩選出誘導分化前后差異表達的miRNAs，尋找可能的人BMSCs向軟骨分化過程中具有調控作用的miRNAs，為進一步闡明miRNA在BMSCs軟骨分化過程中的作用和意義提供實驗基礎。
　　方法：（1）利用密度梯度離心法自人骨髓中分離BMSCs，在體外擴增傳代培養(yǎng)，通過對其形態(tài)特點的觀察及細胞表面標志物檢測，對培養(yǎng)的人BMSCs進行鑒定。（

2、2）采用體外細胞團三維培養(yǎng)方法，用含有TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C的培養(yǎng)液誘導人BMSCs向軟骨細胞方向分化，通過甲苯胺藍、s-100蛋白免疫組織化學染色對誘導分化的軟骨細胞進行鑒定。（3）利用miRNA基因芯片技術，檢測人BMSCs及其誘導分化的軟骨細胞miRNAs的表達譜，通過SAM軟件分析篩選出人BMSCs和其分化的軟骨細胞之間表達差異性的miRNAs。（4）采用實時定量PCR方法對篩選出的差異表達的mi

3、RNA基因進行驗證并預測其潛在的靶基因。
　　結果：（1）經(jīng)骨髓分離培養(yǎng)所得到的細胞，通過流式細胞儀檢測的結果為：細胞表面標志物CD29、CD44為陽性，CD34、CD45為陰性，符合骨髓間充質干細胞特征。（2）人BMSCs經(jīng)TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C誘導21天后，甲苯胺藍、s-100蛋白免疫組織化學染色均陽性，符合軟骨細胞的特征。（3）用miRNA基因芯片檢測了兩組樣品中人BMSCs及其誘導分化的軟骨

4、細胞miRNAs的表達譜，并篩選出了在該兩種細胞中表達的差異性的miRNAs。在兩組樣品中，軟骨細胞較BMSCs高表達的miRNAs分別為：26個、7個（兩組共同存在的為5個）；軟骨細胞較BMSCs低表達的miRNAs在兩組樣品中分別為：1個、2個（兩組共同存在的為0個）。（4）針對篩選出的4個在軟骨中高表達的miRNAs利用實時定量PCR的方法在第3組樣品中進行驗證，結果均與芯片檢測的結果一致。
　　結論：（1）用密度梯度離心法