Wntll調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程的機(jī)理研究.pdf

1、前言
　　由關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷等原因造成的軟骨缺損及功能障礙是臨床上面臨的難題之一[1]。利用軟骨組織工程的方法再造軟骨治療軟骨損傷，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景[2]。臨床中，如何能盡快地形成新的骨組織至關(guān)重要，不僅可以縮短骨折愈合的時(shí)間，也為盡快地恢復(fù)骨的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，要首先了解軟骨細(xì)胞形成的相關(guān)機(jī)制，以及影響軟骨細(xì)胞形成的相關(guān)因子和信號(hào)通路。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalste

2、mcells，BMSCs)是一類具有潛在多分化能力的成體干細(xì)胞，可以在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等不同類型細(xì)胞[3,4]。此外，BMSCs具有極強(qiáng)的自我修復(fù)能力，獲取簡單、增殖力強(qiáng)、來源廣泛、免疫原性弱[5]、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)[6]、不涉及倫理等特點(diǎn)，成為組織細(xì)胞工程研究的熱點(diǎn)。
　　Wnt蛋白是一類高度保守的分泌型糖蛋白，其作為信號(hào)因子參與了包括生長、發(fā)育和凋亡在內(nèi)的眾多進(jìn)程[7]。Wnt通過作用于細(xì)胞膜上的受

3、體，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路受體LRP5發(fā)生功能缺失突變后會(huì)造成骨質(zhì)疏松的表型，表明Wnt信號(hào)通路在骨形成過程中起重要作用[8]。有研究表明，在小鼠肢體發(fā)育及軟骨分化過程中檢測到了多種Wnt基因的表達(dá)[9]。Wnt3a可以促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并抑制其分化為成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞[10,11]。Wnt5a調(diào)控軟骨細(xì)胞的形成，Wnt5b抑制軟骨細(xì)胞的分化[12，13]。在間質(zhì)凝結(jié)(mes

4、enchymalcondensations)中過表達(dá)Wnt1，Wnt7a或者Wnt14會(huì)抑制其分化為軟骨細(xì)胞[14-16]。上述研究表明Wnt信號(hào)通路可能在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化方面起重要作用。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Wnt11可以在軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen)的表達(dá)[17]。Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量的增加是間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的標(biāo)志事件之一，這表明Wnt11可能在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中起重要作用。此外，X

5、u等人的研究發(fā)現(xiàn)在三維藻朊酸鹽凝膠上誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過程中Wnt11基因在誘導(dǎo)分化的中后期階段高表達(dá)[18]。
　　生長因子在BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的過程中起到了非常關(guān)鍵的作用，已有學(xué)者研究得出，TGF-β1能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化[19,20]。TGF-β1在誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的過程中，對(duì)軟骨細(xì)胞的分化和功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)未分化或分化早期的軟骨細(xì)胞DNA合成、增殖、分化及細(xì)胞

6、外基質(zhì)的合成，抑制成熟軟骨細(xì)胞的增殖和分化。這種雙向調(diào)節(jié)作用與TGF-β1的濃度密切相關(guān)，有研究表明[21,22]，不同濃度的TGF-β1可能通過影響B(tài)MP-2，進(jìn)而影響B(tài)MSCs向軟骨細(xì)胞的分化，濃度過低，不足以引發(fā)BMP-2的表達(dá)，不能誘導(dǎo)軟骨的形成，濃度過高，則導(dǎo)致BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的潛能下降，不利于誘導(dǎo)分化。
　　JNK通路是MAPK通路家族的三大主要成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)三種，分別由三個(gè)基因編碼，JNK1、JNK2、

7、JNK3。該途徑的特點(diǎn)之一是可被多種應(yīng)激因素激活，，也可被多種類型的細(xì)胞表面受體激活。相對(duì)于ERK途徑，就目前的研究，對(duì)JNK途徑在MSCs分化中的作用及其在軟骨細(xì)胞增殖和分化過程中的作用還不是十分明確。有學(xué)者經(jīng)研究得出IL-17通過JNK途徑誘導(dǎo)MMP13和aggrecanase的表達(dá)從而引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解[23]。
　　蛋白激酶C(PKC)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛分布于機(jī)體各器官、組織和細(xì)胞中，是肌醇磷脂信號(hào)

8、通路的中心環(huán)節(jié)。DelCarol[24]等研究認(rèn)為激活PKCβ1通路，結(jié)果導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡，若添加特異性PKCβ1抑制劑，可完全抑制軟骨細(xì)胞死亡。Ciarmatori[25]等研究認(rèn)為，PKC信號(hào)通路與多種信號(hào)通路一起參與了誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和早期分化過程。以上的研究表明，PKC作為重要的信號(hào)因子，參與調(diào)解軟骨細(xì)胞生長、增殖、分化等多種生物學(xué)效應(yīng)，但尚缺乏具體機(jī)制。
　　本研究擬采用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，通過慢病毒介導(dǎo)的

9、轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將Wnt11轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)合體外誘導(dǎo)軟骨形成等實(shí)驗(yàn)，在TGF-β1存在的條件下，加入或不加入JNK和PKC抑制劑，探討TGF-β1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中的協(xié)同作用。
　　材料和方法
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、主要試劑
　　DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）
　　PBS（Hyclone，美國）
　　FBS（Hyclone，美國）
　　胰酶（Hyclone，美

10、國）
　　HISTOPAQUE-1083（Sigma，美國）
　　MTT（Sigma，美國）
　　DMSO（Sigma，美國）
　　細(xì)胞周期檢測試劑盒（Hyclone，美國）
　　Polybrene（Sigma，美國）
　　引物（生工，中國）
　　PCR試劑盒（Hyclone，美國）
　　多聚甲醛（Hyclone，美國）
　　Cy3標(biāo)記山羊抗兔（Hyclone，美國）
　　tr

11、itonX100（Hyclone，美國）
　　山羊血清（Hyclone，美國）
　　DAPI（Sigma，美國）
　　Wnt11（Santa，美國）
　　COL2A1（Santa，美國）
　　Wnt11抗體（Santa，美國）
　?、蛐湍z原多克隆抗體（Santa，美國）
　　Aggrecan抗體（Santa，美國）
　　BCA蛋白濃度測定試劑盒（Hyclone，美國）
　　預(yù)染蛋白分

12、子量標(biāo)準(zhǔn)（Fermentas，加拿大）
　　TGF-β1（Hyclone，美國）
　　JNK抑制劑（Hyclone，美國）
　　PKC抑制劑（Hyclone，美國）
　　成軟骨誘導(dǎo)液（Hyclone，美國）
　　阿爾新藍(lán)（Hyclone，美國）
　　2、主要儀器
　　倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）
　　CO2培養(yǎng)箱（力申，中國）
　　超凈工作臺(tái)（安泰，中國）
　　流式細(xì)

13、胞儀（BD，美國）
　　酶標(biāo)儀（BIOTEK，美國）
　　紫外分光光度計(jì)（Thermo，美國）
　　熒光定量PCR儀（Thermo，美國）
　　激光共聚焦掃描顯微鏡（OLYMPUS，日本）
　　雙垂直蛋白電泳儀（BD，美國）
　　凝膠成像系統(tǒng)（Thermo，美國）
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　采用密度梯度離心法從大鼠后臀的脛骨和股骨骨髓腔

14、中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的CD34，CD45，CD44和CD29等進(jìn)行鑒定。
　　2、構(gòu)建Wnt11慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　細(xì)胞分為Wnt11+eGFP基因轉(zhuǎn)染組，慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，以熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞生長情況。
　　3、檢測細(xì)胞的Wnt11表達(dá)水平
　　在2中的三組細(xì)胞中加入Wnt11抗體，分別以免疫熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR法

15、和westernblot法檢測2中細(xì)胞的Wnt11表達(dá)水平。
　　4、檢測細(xì)胞的增殖情況
　　利用MTT法檢測2中的三組細(xì)胞的增殖情況。
　　5、檢測Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平
　　在2中的三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中加入軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體，分別以實(shí)時(shí)定量PCR法和westernblot法檢測Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平，再利用免疫組化檢測上述

16、三組細(xì)胞中CollagenⅡ的表達(dá)情況。
　　6、TGF-β1對(duì)體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)的研究
　　將2中的三組細(xì)胞分別在加入或不加入TGF-β1情況下進(jìn)行體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色，并測定OD590處的吸光值;利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Aggrecan，CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9，RUNX2和Ihh的表達(dá)水平。
　　7、抑制劑對(duì)體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)的研究
　　TGF-β1存在的情況下，在培

17、養(yǎng)基中分別加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X，進(jìn)行體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成的軟骨細(xì)胞中Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)量的變化情況。
　　結(jié)果
　　1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　流式細(xì)胞儀檢測得出CD34、CD45、CD44、CD29的陽性表達(dá)率分別為3.25％、4.25％、95.73％、93.71％，證實(shí)所分離培養(yǎng)

18、的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后細(xì)胞生長良好，轉(zhuǎn)染效率提高
　　Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的BMSC中，熒光顯微鏡下觀察得出細(xì)胞生長良好，轉(zhuǎn)染效率提高。
　　3、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后，Wnt11表達(dá)上調(diào)
　　Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的BMSC中，免疫熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR法和westernblot法檢測得出Wnt11的表達(dá)上調(diào)，明顯高于慢病毒空載體

19、轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。
　　4、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后抑制細(xì)胞的增殖
　　三組細(xì)胞均在第四天增殖能力達(dá)到峰值，Wnt11+eGFP基因轉(zhuǎn)染組的BMSC的OD值小于其他兩組，說明通過Wnt11慢病毒轉(zhuǎn)染抑制了BMSC的增殖。
　　5、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后，Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)水平上調(diào)
　　在加入軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體后，實(shí)時(shí)定量

20、PCR法和westernblot法檢測得出，基因轉(zhuǎn)染組BMSC的Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)水平上調(diào)，其他兩組無明顯差異。另外，免疫組化檢測得出基因轉(zhuǎn)染組BMSC的CollagenⅡ呈陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，其他兩組無明顯變化。
　　6、TGF-β1可以促進(jìn)BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成
　　三組BMSC在加入TGF-β1的情況下，經(jīng)阿爾新藍(lán)染色得出，OD590的值要明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。Real-t

21、imePCR檢測得出，加入TGF-β1的情況下，Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表達(dá)上調(diào)，明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。
　　7、JNK和PKC抑制劑可以抑制BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成
　　在TGF-β1存在的情況下，經(jīng)Real-timePCR檢測得出，加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X的BMSC，Aggrecan、CollagenⅡ的

22、表達(dá)下調(diào)，明顯低于未加入抑制劑組BMSC。
　　結(jié)論
　　1、BMSC經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，抑制BMSC的增殖，Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平上調(diào)，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、在經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的BMSC中加入TGF-β1，可以使軟骨標(biāo)志性基因Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9，、RUNX2和Ihh的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成。