Wnt3a對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化影響的研究.pdf

1、目的:觀測Wnt3a過表達(dá)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成軟骨能力的變化，以及Wnt3a影響B(tài)MSCs增殖、分化的相關(guān)機制。
　　方法:通過慢病毒在大鼠BMSCs中分別導(dǎo)入Wnt3a基因和Mock（陰性無功能基因片段）基因;使用熒光顯影及Western Blot對導(dǎo)入效果進行鑒定。MTT法分析Wnt3a對BMSCs增殖的作用，進而甲苯胺藍(lán)染色檢測基質(zhì)蛋白聚糖的生成情況，并使用實時熒光定量PCR檢測軟骨分化標(biāo)志基因COL2A1、A

2、ggrecan和SOX9的mRNA水平。通過觀測β-catenin、Ca2+、磷酸化CaMKⅡ等蛋白與離子的變化判斷Wnt3a影響B(tài)MSCs軟骨分化的途徑，并使用DKK1和KN93分別抑制經(jīng)典及非經(jīng)典途徑，以分析各途徑在Wnt3a影響B(tài)MSCs增殖、分化過程中的作用。
　　結(jié)果:所有BMSCs經(jīng)慢病毒感染后用熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá);Western Blot發(fā)現(xiàn)Wnt3a轉(zhuǎn)染BMSCs后，其基因能夠表達(dá)。MTT分析顯示過

3、表達(dá)Wnt3a的BMSCs增殖率顯著高于對照組(P＜0.05);甲苯胺藍(lán)染色顯示BMSCs中Wnt3a的過表達(dá)降低了基質(zhì)蛋白聚糖的積累;Wnt3a表達(dá)上調(diào)同時導(dǎo)致COL2A1、 Aggrecan和SOX9的mRNA水平顯著降低(P＜0.05)。Wnt3a的過表達(dá)造成了經(jīng)典途徑特異性標(biāo)志物β-catenin的上調(diào);在過表達(dá)Wnt3aBMSCs的細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高(P＜0.05)，并導(dǎo)致磷酸化CaMKⅡ濃度升高(P＜0.05)，而對內(nèi)

4、源性CaMKⅡ的表達(dá)無影響。用特異性抑制劑DKK1阻斷了經(jīng)典途徑后發(fā)現(xiàn)，BMSCs的增殖回歸自然水平，但基質(zhì)蛋白聚糖進一步減少，COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA保持在低水平;用特異性抑制劑KN93阻斷了非經(jīng)典途徑后發(fā)現(xiàn)，BMSCs的增殖能力不受其影響，而且基質(zhì)蛋白聚糖顯著增加， COL2A1、Aggrecan和SOX9 mRNA的水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1) Wnt3a增強了BMSCs的增殖。