野生與人工養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇(Naja atra)毒液的比較研究.pdf

1、近年來(lái)，中華眼鏡蛇的食用和藥用等價(jià)值逐漸被重視，但由于多種因素導(dǎo)致野生中華眼鏡蛇數(shù)量減少，因此，為達(dá)到滿足市場(chǎng)需求和保護(hù)野生動(dòng)物等目的，目前普遍采用人工飼料喂養(yǎng)和無(wú)冬眠快速養(yǎng)殖等技術(shù)大量養(yǎng)殖中華眼鏡蛇。但是，已有報(bào)道指出野生與養(yǎng)殖毒蛇的毒液間存在一定差異，而目前為止，暫未見(jiàn)對(duì)其具體差異進(jìn)行系統(tǒng)性比較分析的相關(guān)報(bào)道。蛇毒主要由幾十種蛋白質(zhì)（酶）或多肽構(gòu)成的混合物（或“彈藥庫(kù)”），這些蛋白或多肽是由毒腺細(xì)胞里的毒素基因轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)出的，已有

2、研究表明編碼這些毒素的基因是經(jīng)過(guò)億萬(wàn)年的加速進(jìn)化被募集到毒腺細(xì)胞里產(chǎn)生的，進(jìn)而造成毒素蛋白的差異性。因此，本研究從毒液組成、成分活性、毒理學(xué)研究、毒素基因的轉(zhuǎn)錄組水平、不同喂養(yǎng)的食物等方面對(duì)野生和人工養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液進(jìn)行了比較分析，為人工養(yǎng)殖中華眼鏡蛇的蛇毒生產(chǎn)及其咬傷治療所用的抗蛇毒血清生產(chǎn)提供理論支持或指導(dǎo)。本研究通過(guò)系統(tǒng)性研究與分析，得到以下結(jié)果：
　?、?SDS-PAGE比較結(jié)果：變性SDS-PAGE顯示，野生比養(yǎng)殖的

3、眼鏡蛇毒液多一條蛋白帶（95 kD），且在55 kD處的蛋白含量較高；非變性SDS-PAGE顯示，野生比養(yǎng)殖眼鏡蛇毒液在170 kD處的含量高；RP-HPLC顯示，野生比養(yǎng)殖眼鏡蛇毒液在20min、50min處的出峰面積大。
　　②酶活性比較結(jié)果：卵磷脂平板法進(jìn)行PLA2活性測(cè)定，結(jié)果顯示：上樣量為30μg的野生的與養(yǎng)殖的眼鏡蛇毒液水解卵磷脂后的透明圈平均直徑分別為16.45 mm、18.38 mm；透明質(zhì)酸平板法進(jìn)行透明質(zhì)酸酶活

4、性測(cè)定，結(jié)果顯示：上樣量為30μg的野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液水解透明質(zhì)酸后的透明圈平均直徑分別為12.81 mm、11.57 mm；亮氨酸為底物，測(cè)得上樣量為10μg的野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液L-AAO酶活性分別為0.341、0.397（用490 nm處吸光值表示活性大小）；PNPP為底物，測(cè)得上樣量為30μg野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液的堿性磷酸單酯酶活性分別為0.199、0.184（405 nm處的吸光值表示活性大小）；碘化

5、乙酰膽堿為底物，測(cè)得30μg的野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液的乙酰膽堿酯酶活性分別為0.297、0.413（用405 nm處的吸光值表示活性大小）；Azo-casein為底物，測(cè)得30μg的野生的與養(yǎng)殖的眼鏡蛇毒液的蛋白水解酶活性吸光值分別為0.104、0.106（630 nm處的吸光值表示活性大小），二者活性無(wú)顯著差異；AMP為底物，測(cè)得20μg的野生的與養(yǎng)殖的眼鏡蛇毒液的5’-核苷酸酶活性，酶活力大小分別為82.17 U、75.83

6、U。
　?、鄱纠砘钚员容^結(jié)果：經(jīng)小鼠足趾皮下注射8μg的野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液后的足趾脹脹厚度分別為3.6 mm、3.86 mm；經(jīng)小鼠尾靜脈注射8μg的野生的與養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液后鎮(zhèn)痛時(shí)間分別延長(zhǎng)至7.5 s、6.86 s；經(jīng)小鼠腹腔注射野生的與養(yǎng)殖的眼鏡蛇毒液引起LD50的量無(wú)明顯差異，分別為0.79μg/g、0.81μg/g，但野生眼鏡蛇毒液的致死速度比養(yǎng)殖的中華眼鏡蛇毒液的快。
　?、苻D(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示人工養(yǎng)

7、殖的中華眼鏡蛇毒腺中5’-NT、L-AAO、蛋白水解酶、乙酰膽堿酯酶的表達(dá)量相對(duì)于野生的呈上調(diào)趨勢(shì)；PLA2、3-FTX的表達(dá)量相對(duì)于野生的呈下調(diào)趨勢(shì)。
　?、蒺B(yǎng)殖組中華眼鏡蛇的食物不同，導(dǎo)致其生長(zhǎng)速度存在一定差異：食用活小鼠的中華眼鏡蛇其生長(zhǎng)速度較慢，喂養(yǎng)人工飼料的蛇則生長(zhǎng)速度較快。而非還原SDS-PAGE顯示：食用活體小鼠的成蛇，其毒液蛋白比喂養(yǎng)人工飼料的成蛇的毒液蛋白多一條蛋白帶（90 kD）；而食用活體小鼠的幼蛇，其毒液的