眼鏡蛇細(xì)胞毒素CTXn、CTX1戒毒作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素有效組分CTXn、CTX1 對(duì)抗嗎啡依賴作用及機(jī)制。
　　 方法：
　　 （1）建立嗎啡依賴CPP 模型，觀察眼鏡蛇毒中分離粗毒細(xì)胞毒素Ⅳ低、中、高劑量對(duì)嗎啡成癮大鼠CPP 影響，及對(duì)催促戒斷行為學(xué)影響。
　　 （2）篩選: SD 大鼠嗎啡(10mg/kg，sc)訓(xùn)練8 天,形成穩(wěn)定CPP 模型后，大鼠分為粗毒毒素Ⅳ各單體組分高劑量組、嗎啡成癮對(duì)照組及0.9％N.S 組，實(shí)驗(yàn)組給予粗毒毒

2、素Ⅳ不同組分1/10 LD50 劑量,觀察各組分對(duì)嗎啡已形成CPP 影響。
　　 （3）觀察CTXn 對(duì)嗎啡CPP 獲得和維持影響。①建立嗎啡依賴模型后，腹腔給予CTXn 不同劑量（0.5、1.0、2.0mg/kg）連續(xù)5天，測(cè)試CPP 及痛覺(jué)變化,大腦切片,免疫組化染色,觀察TNF-α在齒狀回表達(dá)；② SD 大鼠在施嗎啡前30分鐘腹腔給予不同劑量CTXn（0.5、1.0、2.0mg/kg），連續(xù)8 天，觀察CTXn 預(yù)處理對(duì)嗎

3、啡CPP 獲得及鎮(zhèn)痛影響；③ SD 大鼠腹腔注射不同劑量CTXn（0.5、1.0、2.0mg/kg），連續(xù)18 天，觀察其自身是否引起CPP；④ SD 大鼠分別腹腔給予CTXn（1.0mg/kg）或鞘內(nèi)給予CTXn(0.025mg/kg)，連續(xù)用藥24 天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24測(cè)試大鼠痛閾，觀察痛閾變化，同時(shí)在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24 采用E

4、LISA 法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　 （4）觀察CTX1 對(duì)嗎啡CPP 獲得和維持影響。①建立嗎啡依賴模型后，再腹腔給予不同劑量CTX1（0.1、0.2、0.4mg/kg）連續(xù)5天，測(cè)試CPP 及痛覺(jué)變化，大腦切片，免疫組化染色，觀察TNF-α在海馬的表達(dá)；② SD 大鼠在施嗎啡前30 分鐘腹腔給予CTX1 不同劑量（0.1、0.2、0.4mg/kg），連續(xù)8 天，觀察CTX1預(yù)處理對(duì)嗎啡CPP 獲得及鎮(zhèn)痛影響、TNF-α的含量

5、變化及其在CA 區(qū)表達(dá)、LTP；③ SD 大鼠腹腔注射不同劑量CTX1（0.1、0.2、0.4mg/kg），連續(xù)8 天，觀察其自身是否引起CPP；④ SD 大鼠分別腹腔給予CTX1（0.2mg/kg）組或鞘內(nèi)給予CTX1(10μg/kg)，連續(xù)用藥24 天在d0、d2、d4、d6、d8、d10、d12、d14、d16、d18、d20、d22、d24測(cè)試大鼠痛閾，觀察痛閾變化，在d0、d4、d8、d12、d16、d20、d24 采用ELI

6、SA 法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 （1）嗎啡可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生明顯CPP，眼鏡蛇粗毒細(xì)胞毒素Ⅳ高、中、低劑量組自身均不能引起CPP;不同劑量粗毒細(xì)胞毒素Ⅳ可抑制嗎啡已形成CPP,抑制納洛酮誘導(dǎo)的戒斷癥狀。
　　 （2）細(xì)胞毒素Ⅳ分離純化得到5個(gè)組分，分別為：Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ4、Ⅳ5、Ⅳ7。
　　 其中組分Ⅳ4、Ⅳ5可抑制大鼠引起CPP;抑制納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀，與組分Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7 不同，組分Ⅳ4

7、、Ⅳ5組大鼠體重平均增長(zhǎng)分別為：15.5％、17.1 與生理鹽水組增長(zhǎng)相似，Ⅳ1、Ⅳ3、Ⅳ7 組大鼠體重平均增長(zhǎng)為6.2％、4.9、8.8％與嗎啡對(duì)照組相似。氨基酸序列測(cè)定組分Ⅳ4 為CTXn，組分Ⅳ5為CTX1。
　　 CTXn 序列：LKCNQ LIPPF YKTCA AGKNL CYKMF MVAAP KVPVK RGCIDVCPKS SLLVK YVCCN TDRCNCTX1 序列：LKCNK LIPIA SKTCP A

8、GKNL CYKMF MMSDL TIPVK RGCIDVCPKS NLLVK YVCCN TDRCN。
　　 （3）CTXn 對(duì)嗎啡CPP 獲得和維持影響①大鼠嗎啡成癮后CTXn 處理可劑量依賴性地抑制嗎啡誘導(dǎo)CPP 及痛敏。CTXn 不同劑量組（0.5、1.0、2.0mg/kg）CPP值分別從成癮時(shí)的451.8s±49.2s、450.8s±72.3s 及450.7s±91.2s 下降到164s±49.5s、77.4s±41.

9、1s 及68.2s±37.2s；大鼠痛閾值分別從成癮時(shí)15.5s±1.6s、15.2s±3.2s 及15.6s±2.3s，提高至22.4s±1.7s、27.5s±2.8s 及28.6s±3.6s。②嗎啡成癮后，CTXn后處理可明顯增加齒狀回TNF-α表達(dá)，一定程度上恢復(fù)齒狀回神經(jīng)元數(shù)量。③CTXn預(yù)處理后，大鼠CPP 值未見(jiàn)顯著升高，可劑量依賴性抑制嗎啡CPP 獲得。預(yù)處理呈劑量依賴性的增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用。④ CTXn 自身不會(huì)產(chǎn)生CPP。C

10、TXn 腹腔用藥后，血清CTXn 抗體效價(jià)增高，鎮(zhèn)痛效力下降；但CTXn 鞘內(nèi)給藥未見(jiàn)CTXn抗體產(chǎn)生及鎮(zhèn)痛耐受。
　　 （4）CTX1 對(duì)嗎啡CPP 獲得和維持影響：①大鼠嗎啡成癮后CTX1 后處理可劑量依賴性地抑制嗎啡誘導(dǎo)CPP 維持及痛覺(jué)過(guò)敏。大鼠成癮后，CTX1 處理可明顯增加海馬CA 區(qū)TNF-α表達(dá)。② CTX1 預(yù)處理可劑量依賴性地抑制嗎啡誘導(dǎo)CPP獲得，鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴性。CTX1 可明顯增加在血清中TNF-α

11、含量及在海馬CA 區(qū)表達(dá)，解除嗎啡對(duì)LTP的影響。③ CTX1 自身不會(huì)產(chǎn)生CPP。CTX1 腹腔用藥后，血清抗CTX1 抗體效價(jià)逐漸增高，鎮(zhèn)痛作用相應(yīng)下降，但CTX1 鞘內(nèi)給藥后未見(jiàn)抗體產(chǎn)生及鎮(zhèn)痛耐受。
　　 結(jié)論：
　　 （1）細(xì)胞毒素Ⅳ中分離純化的單體組分CTXn和CTX1 劑量依賴性抑制嗎啡誘導(dǎo)CPP 獲得及維持。
　　 （2）CTXn和CTX1 自身沒(méi)有成癮性，二者可抑制嗎啡誘導(dǎo)CPP 獲得，預(yù)防嗎啡成