中華眼鏡蛇毒對HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:通過使用中華眼鏡蛇毒干預(yù)體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞),檢測對其增殖和凋亡的影響以及可能機(jī)制,以探索其用于治療銀屑病的可能性,為下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)運(yùn)用于合理、有效治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:①角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的培養(yǎng)和傳代。②CellCountingkit-8法確定蛇毒對HaCaT細(xì)胞的適用劑量及對其體外增殖的影響。③倒置光學(xué)顯微鏡觀察正常組及凋亡細(xì)胞形態(tài)。④AnnexinⅤ/PI雙染色法檢

2、測蛇毒不同濃度及不同干預(yù)時(shí)間細(xì)胞凋亡率的比較和變化,分別用倒置熒光相差顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀測定凋亡壞死率。⑤分光光度法檢測不同蛇毒濃度作用時(shí)caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性變化。
　　結(jié)果:①.角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察顯示細(xì)胞呈典型上皮樣特征,貼壁后呈“鋪路石”狀。②CCK-8法中,濃度為1、2、4、8、16和32μg/ml蛇毒分別作用24h、48h和72h后,與對照組相比,

3、眼鏡蛇毒能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖(P<0.05),且抑制率升高具有濃度和時(shí)間依賴性。③倒置熒光相差顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)顯示凋亡晚期細(xì)胞可同時(shí)被AnnexinⅤ和PI雙染,光鏡顯示細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,每高倍顯微鏡視野下凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨蛇毒濃度的增加明顯增多,且多見凋亡晚期的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀測定HaCaT細(xì)胞均顯示與對照組相比凋亡壞死率隨著濃度增高及作用時(shí)間延長升高(P<0.05)。④分光光度法檢測不同蛇毒濃度作用時(shí)cas

4、pase-3和caspase-9的活性隨著蛇毒濃度的升高有明顯增加,與對照組相比以及兩兩相比,P<0.05,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨著蛇毒濃度增大,相同時(shí)間干預(yù)后Caspase-8活性無明顯變化,P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1、中華眼鏡蛇毒能在體外抑制HaCaT細(xì)胞的增殖。2、中華眼鏡蛇毒可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡壞死,且以晚期凋亡和壞死為主。3、caspase-3和caspase-9在中華眼鏡蛇毒誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的