中華眼鏡蛇毒對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:通過使用中華眼鏡蛇毒干預體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞),檢測對其增殖和凋亡的影響以及可能機制,以探索其用于治療銀屑病的可能性,為下一步的體內(nèi)實驗以及臨床實驗運用于合理、有效治療銀屑病提供實驗依據(jù)。
　　方法:①角質(zhì)形成細胞HaCaT的培養(yǎng)和傳代。②CellCountingkit-8法確定蛇毒對HaCaT細胞的適用劑量及對其體外增殖的影響。③倒置光學顯微鏡觀察正常組及凋亡細胞形態(tài)。④AnnexinⅤ/PI雙染色法檢

2、測蛇毒不同濃度及不同干預時間細胞凋亡率的比較和變化,分別用倒置熒光相差顯微鏡觀察及流式細胞儀測定凋亡壞死率。⑤分光光度法檢測不同蛇毒濃度作用時caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性變化。
　　結(jié)果:①.角質(zhì)形成細胞HaCaT在光學顯微鏡下形態(tài)學觀察顯示細胞呈典型上皮樣特征,貼壁后呈“鋪路石”狀。②CCK-8法中,濃度為1、2、4、8、16和32μg/ml蛇毒分別作用24h、48h和72h后,與對照組相比,

3、眼鏡蛇毒能抑制HaCaT細胞的增殖(P<0.05),且抑制率升高具有濃度和時間依賴性。③倒置熒光相差顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)顯示凋亡晚期細胞可同時被AnnexinⅤ和PI雙染,光鏡顯示細胞呈現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)學改變,每高倍顯微鏡視野下凋亡細胞的數(shù)量隨蛇毒濃度的增加明顯增多,且多見凋亡晚期的細胞。流式細胞儀測定HaCaT細胞均顯示與對照組相比凋亡壞死率隨著濃度增高及作用時間延長升高(P<0.05)。④分光光度法檢測不同蛇毒濃度作用時cas

4、pase-3和caspase-9的活性隨著蛇毒濃度的升高有明顯增加,與對照組相比以及兩兩相比,P<0.05,差異具統(tǒng)計學意義;隨著蛇毒濃度增大,相同時間干預后Caspase-8活性無明顯變化,P>0.05,差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:1、中華眼鏡蛇毒能在體外抑制HaCaT細胞的增殖。2、中華眼鏡蛇毒可誘導HaCaT細胞的凋亡壞死,且以晚期凋亡和壞死為主。3、caspase-3和caspase-9在中華眼鏡蛇毒誘導HaCaT細胞的