TSG101在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及意義.pdf

1、人腫瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)位于11P15.1-15.2，cDNA全長1494bp，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，其編碼產(chǎn)物為含380個氨基酸分子量43KD的蛋白質(zhì)。TSG101蛋白包括N-端為泛素連接酶E2樣結(jié)構(gòu)域、脯氨酸富集區(qū)(人TSG101第130-205個氨基酸)和C-端螺旋卷曲結(jié)構(gòu)(TSG101第231-302個氨基酸)及一個穩(wěn)定盒SB(steadiness box d

2、omain)控制其穩(wěn)定水平。TSG101基因與細(xì)胞生長密切相關(guān)，細(xì)胞TSG101含量不足或過量均能引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化或細(xì)胞周期紊亂。研究證實TSG101N是泛素連接酶的轉(zhuǎn)錄抑制因子，只有保留螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的TSG101蛋白質(zhì)才具有轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。 目前，在髓系細(xì)胞白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌和宮頸癌關(guān)于TSG101的報道，但結(jié)果不盡相同。我們的實驗組前期的實驗表明，TSG101在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)低于正常肺組織，且隨

3、分化水平的降低TSG101表達(dá)水平下調(diào)。然而，其他研究表明在部分乳腺癌和宮頸癌的亞型中TSG101高表達(dá)，并且可能與TSG101基因的異常轉(zhuǎn)錄有關(guān)。目前，關(guān)于TSG101基因異常截短的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和肺癌各組織學(xué)亞型的關(guān)系，國內(nèi)外鮮有報道。為此本實驗在回顧肺鱗癌和腺癌TSG101表達(dá)的基礎(chǔ)上，著重通過Western Blotting和RT-PCR方法檢測肺癌細(xì)胞系中TSG101及異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)情況，分析它們在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為闡明肺

4、癌發(fā)生機(jī)制和尋找治療肺癌的方法提供依據(jù)。 材料和方法： 1、材料 收集79例肺癌組織，取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2005～2007年手術(shù)切除標(biāo)本。其中鱗癌48例，肺腺癌31例；中、高分化51例，低分化28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者45例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者34例。7株肺癌細(xì)胞系(SK和QG為肺鱗癌細(xì)胞系，661和460是大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，SPC和LTE是肺腺癌細(xì)胞系，446為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)。 2、主要試劑和

5、來源 濃縮型鼠抗人TSG101單克隆抗體(sc-7964)購自美國Santa Cruz公司，濃縮型辣根標(biāo)記山羊抗小鼠(ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 RNA抽提試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自大連TakaRa公司。引物序列合成由大連TakaRa公司完成。 3、方法： (1)免疫組織化學(xué)染色79例肺鱗癌和肺腺癌均行TSG101(1：200)單抗免

6、疫組織化學(xué)染色。染色方法按說明書進(jìn)行。以磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline PBS)代替一抗作為陰性對照，TSG101陽性切片作為陽性對照。 (2)RT-PCR利用Triol(Invitrogen)提取細(xì)胞系總的RNA，利用RT-PCR．檢測TSG101mRNA序列及其剪接變異體，反轉(zhuǎn)錄的質(zhì)量通過β-actin來檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后保存圖像。 (3)Western Blot鼠抗人TSG10

7、1單克隆抗體(1：200)，4℃孵育過夜，TBS漂洗后，加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1：2000)溫育120min，最后用DAB顯色． (4)統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用x2檢驗分析免疫組化結(jié)果，采用t檢驗分析Western Blot圖像灰度值和RT-PCR圖象的平均光密度值，P<0.05為有非常顯著性差異。 結(jié)果： 1、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果盡管在正常對照的癌旁組織強(qiáng)表達(dá)，但是在低分化

8、的肺鱗癌和肺腺癌中微弱或無表達(dá)，在高中分化的肺鱗癌和肺腺癌中低表達(dá)，并且主要在胞漿中表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在間質(zhì)也有表達(dá)。TSG101的表達(dá)水平與肺癌組織分化(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)等臨床病理參數(shù)有顯著關(guān)系，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加，TSG101的陽性率下降。 2、RT-PCR結(jié)果利用檢測全長序列引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)除了有全長產(chǎn)物外，在488bp處發(fā)現(xiàn)有剪接變異體的產(chǎn)物，并且小細(xì)胞肺癌細(xì)胞含量較多，與Maxwe

9、ll研究的TSG101△154-1054一致。并且小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系446與其他非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系相比，全長產(chǎn)物較少，而縮短的剪接變異產(chǎn)物相對較多，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 為了進(jìn)一步確定縮短的剪接變異體的類型，在跨過剪接點(diǎn)設(shè)計引物特異檢測TSG101△154-1054，同樣發(fā)現(xiàn)有預(yù)期產(chǎn)物出現(xiàn)。同樣經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3、Western Blot結(jié)果七種肺癌細(xì)胞

10、系細(xì)胞中均有TSG101蛋白表達(dá)，但是小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系表達(dá)較其他非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系表達(dá)明顯較低。 討論： 腫瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)最初是被作為侯選的腫瘤抑制基因進(jìn)行研究。我們的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也顯示，TSG101在肺鱗癌和肺腺癌中的蛋白水平顯著低于其在相應(yīng)正常肺組織中的表達(dá)，并且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。 然而，Maxwell等在乳腺癌的研究中沒有發(fā)現(xiàn)基

11、因內(nèi)部丟失或突變的證據(jù)，但是發(fā)現(xiàn)存在異常剪接轉(zhuǎn)錄體。我們利用RT-PCR分析不同組織學(xué)類型的肺癌細(xì)胞系基因轉(zhuǎn)錄情況，同樣發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于900bp(154-1054)的丟失的異常選擇性剪接體存在。 我們的Western blot的結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)截短的蛋白質(zhì)，可能的原因是截短的蛋白質(zhì)不存在野生型蛋白質(zhì)的抗原表位。我們推測A類型的異常剪接體[△900bp(154-1054)]所編碼的蛋白質(zhì)由于缺失區(qū)域位于羧基端，丟失了羧基末端雙螺旋結(jié)構(gòu)(亮

12、氨酸拉鏈)介導(dǎo)的蛋白和蛋白相互作用及隨后丟失的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，提示變異的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的截短的蛋白質(zhì)不具有轉(zhuǎn)錄抑制功能。 我們的結(jié)果顯示，惡性程度較高的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系與其他類型的肺癌相比，全長的mRNA序列和TSG101蛋白水平下降，并且檢測出較高水平的縮短的剪接變異體，與Yun的研究一致，表明TSG101在腫瘤的不同亞型中發(fā)揮不同作用，證實了mRNA的選擇性剪接可以引起正常野生型蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)，并且也說明△154-1054代表