脫細(xì)胞異種真皮的制備及體外PDGF基因轉(zhuǎn)染復(fù)合皮的構(gòu)建.pdf

1、目的：該實(shí)驗(yàn)根據(jù)豬的皮膚組織和人皮膚組織在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，用低濃度胰蛋白酶消化加反復(fù)凍融法制備脫細(xì)胞異種（豬）真皮基質(zhì);構(gòu)建血小板衍化生長因子（PDGF）真核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞;在脫細(xì)胞異種（豬）真皮基質(zhì)上培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞、PDGF基因轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞來構(gòu)建基因復(fù)合皮，從而深入研究組織工程化皮膚的構(gòu)建.方法：1.將斷層豬浸入0.05％胰蛋白酶溶液中4℃過夜消化，無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在PBS溶液中持續(xù)震蕩洗滌，再

2、用同樣濃度的胰蛋白酶消化（37℃，1h），PBS溶液洗滌.然后依次行4℃預(yù)冷、-70℃冷凍各2h，再37℃下融化，如此反復(fù)凍融3次.進(jìn)行免疫組化檢測、細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、大鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn).2.將出生24h內(nèi)的SD大鼠消毒后PBS清洗，切取全厚皮片.用D-Hanks液新鮮配制的0.01％的胰蛋白酶溶液4℃下酶解18～24h.輕輕刮取真皮表皮面和表皮真皮面的角質(zhì)形成細(xì)胞，密度梯度離心（DGC）分離純化角質(zhì)形成細(xì)胞，然后在含有添加劑和

3、胎牛血清的FAD培養(yǎng)基中培養(yǎng).相差顯微鏡觀察，MTT法繪制角質(zhì)形成細(xì)胞生長曲線，AO熒光染色、FCM檢測.3.從原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增出hPDGF-B目的DNA片段.通過連接酶連入真核質(zhì)粒PcDNA3.1中，經(jīng)大腸桿菌DH5α擴(kuò)增和篩選，構(gòu)建出重組真核質(zhì)粒PcDNA3.1-hPDGF-B，進(jìn)行鑒定.然后轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，進(jìn)行表達(dá)檢測.4.利用已制備的脫細(xì)胞異種（豬）真皮基質(zhì)、

4、培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和PDGF基因轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞構(gòu)建三種類型復(fù)合皮：A型，培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞+脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（CK+AX）;B型，培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞+脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)+培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（CK+AX+Fb）;C型，培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞+脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)+PDGF基因轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞（CK+AX+PFb）.通過相差顯微鏡觀察、組織切片HE染色、Pancytokeratin、Laminin和Ⅳ型膠原免疫組化染色等方法進(jìn)行檢測.分別將三型復(fù)合皮

5、分成A、B、C三組，進(jìn)行動物移植實(shí)驗(yàn)，觀察皮片存活率、創(chuàng)面收縮率、真皮血管化程度等，與單純角質(zhì)形成細(xì)胞膜片移植組（D組）和用凡士林紗布覆蓋的對照組（E組）進(jìn)行比較.結(jié)論：1.采用低濃度胰蛋白酶消化加反復(fù)凍融法制備的脫細(xì)胞異種（豬）真皮是含基底膜的以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)，而且無菌、無細(xì)胞、無毒性，是一種簡便有效的方法.為體外復(fù)合皮的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ).2.采用低溫酶消化、密度梯度離心分離純化大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞及含有多種添加劑的FAD培養(yǎng)基進(jìn)行體

6、外大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的方法.通過組織形態(tài)學(xué)、FCM和AO染色等檢測，證實(shí)此方法和培養(yǎng)條件可靠，結(jié)果穩(wěn)定，從而探索出角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件和環(huán)境.3.基因復(fù)合皮的構(gòu)建是組織工程和基因工程結(jié)合的產(chǎn)物.該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建人血小板衍化生長因子-B（PDGF-B）真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，得到良好的表達(dá)結(jié)果.4.用角質(zhì)形成細(xì)胞在脫細(xì)胞異種（豬）真皮上培養(yǎng)，以及角質(zhì)形成細(xì)胞和PDGF基因傳染的成纖維細(xì)胞