慢病毒轉(zhuǎn)染HCN4基因構(gòu)建生物起搏細(xì)胞的體外研究.pdf

1、背景：植入電子起搏器已成為治療癥狀性緩慢性心律失常的首選方法，并取得很大的成功。然而，有限的電池壽命、缺乏對(duì)神經(jīng)激素自動(dòng)反應(yīng)性、兒童期植入起搏器后電極不能隨身體的發(fā)育而相應(yīng)變長等缺點(diǎn)使得人們迫切需要一種更理想的治療方法。國內(nèi)外的學(xué)者研究認(rèn)為利用基因治療和細(xì)胞治療構(gòu)建生物起搏在不久的將來可能會(huì)成為電子起搏器最為理想的替代方法。然而目前有關(guān)生物起搏的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都沒有超過2周，這是否與目前研究者所選用的基因以及基因載體有關(guān)?慢病毒表達(dá)系統(tǒng)因其基

2、因組可以整合于宿主基因組中，長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性，受到廣泛關(guān)注。所以本實(shí)驗(yàn)使用5-aza(5-氮胞苷)誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)將HCN4(超極化激活環(huán)核苷酸門控)起搏基因使用慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察在體外能否構(gòu)建生物起搏細(xì)胞，并能長期表達(dá)，從而為進(jìn)一步在體研究生物起搏打下基礎(chǔ)。 第一部分豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)及5-aza誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的研究 第

3、一節(jié)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng) 目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為5-aza誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞提供材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的原代MSCs10～14d達(dá)到融合，細(xì)胞周期顯示73％的細(xì)胞處于G0/G1期。 結(jié)論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可生長擴(kuò)增，可用于5-aza誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞。 第二節(jié)5-

4、aza體外誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的研究 目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的方法，為構(gòu)建生物起搏細(xì)胞提供新材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，用5-aza誘導(dǎo)后，用抗結(jié)蛋白(desmin)、肌球蛋白重鏈(MHC)、心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)、連接蛋白-43(Cx-43)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。 結(jié)果：體外培養(yǎng)的第二代MSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后，部分MSCs呈梭形，陽性表達(dá)desm

5、in、MHC、cTnI和Cx-43。 結(jié)論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可分化為心肌樣細(xì)胞，可用于構(gòu)建生物起搏細(xì)胞。 第二部分穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4的構(gòu)建及HCN4重組慢病毒的包裝 第一節(jié)穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4的構(gòu)建 目的：將全長約3．6kb的hHCN4目的基因片段從Dr Stieber教授惠贈(zèng)的pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒卸載下來，最終裝載到帶有GFP綠色熒光

6、蛋白標(biāo)記的去內(nèi)毒素穿梭質(zhì)粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上。 方法：用Eco RI和Xba I從pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒切下hHCN4目的片段連接到Puc19載體中，再用Eco砒和Hind III從質(zhì)粒Puc19切下目的片段連接到pcDNA3．1(A)載體中，再用Xba I單酶從質(zhì)粒pcDNA3．1(A)雙切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。用Xba I或者Eco RI鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒送上海生工

7、測序，并將構(gòu)建的目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 結(jié)果：Xba I及Eco RI鑒定表明，PCR的產(chǎn)物和克隆擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳結(jié)果該基因的大小約為3．6kb；陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果與GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同；構(gòu)建的目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和原代的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，均發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的綠色熒光的出現(xiàn)。 結(jié)論：成功將全長hHCN4目的基因片段從pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒卸載下來，裝載到去內(nèi)毒

8、素穿梭質(zhì)粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上，可用于下一步慢病毒的包裝。 第二節(jié) HCN4重組慢病毒的包裝 目的：使用慢病毒包裝系統(tǒng)(pPACKH1-Lentivector Packaging Kit)建立穩(wěn)定的HCN4重組慢病毒。 方法：實(shí)驗(yàn)過程參照SBI的Lentivector Expression System的操作手冊(cè)進(jìn)行。將構(gòu)建好的慢病毒包裝質(zhì)粒混合物混合后感染293T細(xì)胞及心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)

9、胞。 結(jié)果：構(gòu)建的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染293細(xì)胞和心肌樣豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，均發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的綠色熒光的出現(xiàn)，細(xì)胞感染效率可以達(dá)到90％以上。 結(jié)論：成功建立穩(wěn)定的hHCN4重組慢病毒，該病毒載體有很高的轉(zhuǎn)染效率。 第三部分慢病毒轉(zhuǎn)染基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建起搏樣細(xì)胞的體外研究 目的：使用hHCN4重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞獲得穩(wěn)定過表達(dá)HCN4基因的起搏樣干細(xì)胞。 方法：慢病毒轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓

10、基質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程參照SBI的LentivectorExpression System的操作手冊(cè)進(jìn)行；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周后行Western blot鑒定蛋白的表達(dá)并行real-time RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量檢測HCN4目的基因的表達(dá)情況；全細(xì)胞膜片鉗記錄轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCN4通道電流的表達(dá)；轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外長期培養(yǎng)觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染狀態(tài)。 結(jié)果：病毒感染48小時(shí)后，目的細(xì)胞出現(xiàn)大量的熒光；Western blot檢測結(jié)果見圖，可見一

11、約170kDa條帶，與克隆hHCN4通道蛋白分子量相符；RT-PCR顯示慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞hHCN4-RNA是原代細(xì)胞的123倍；膜片鉗記錄在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可記錄到明顯的電壓與時(shí)間依賴性的超極化內(nèi)向電流，即If電流；將轉(zhuǎn)染的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至2個(gè)月時(shí)，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈群體性搏動(dòng)，20℃室溫下的搏動(dòng)頻率為15±1次/分。該病毒載體有很高的轉(zhuǎn)染效率，在體外已獲得至少8個(gè)月的陽性表達(dá)，8個(gè)月后因?yàn)榧?xì)胞污染未進(jìn)一步觀察。 結(jié)論：hH

12、CN4重組慢病毒轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞獲得了穩(wěn)定過表達(dá)HCN4基因的起搏樣干細(xì)胞。這種基因修飾后的心肌樣干細(xì)胞有可能成為一種有效的生物起搏種子細(xì)胞，并期待在緩慢性心律失常的治療技術(shù)上實(shí)現(xiàn)新突破。 第四部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hHCN4起搏通道亞型的電生理特點(diǎn) 目的：全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDH1-GFP-HCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，了解hHCN4起搏通道亞型的電生理特點(diǎn)。 方法：全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pC

13、DH1-GFP-HCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察hHCN4通道電流、通道電流激活曲線及電壓依賴性激活時(shí)間常數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線；改變細(xì)胞外液K+、Na+濃度，觀察K+、Na+對(duì)IhHCN4電流的影響；以河豚毒素(TTX，INa阻斷劑)、四乙胺(TEA，IK阻斷劑)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、異丙基腎上腺素(ISO)、乙酰膽堿(Ach)、銫(Cs+)、ZD7288(If電流特異性阻斷劑)和胺碘酮分別灌流，觀察它們對(duì)IhHCN4電流的影響。

14、 結(jié)果： 1．大多數(shù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的心肌樣骨髓干細(xì)胞可記錄到約-80mV開始激活的一系列超極化內(nèi)向離子流(I hHCN4電流)，該電流激活緩慢，呈電壓、時(shí)間依賴性。電流的激活電位(Vth)、半最大激活電位(V1/2)分別為-83±8mV、-108±2mV，斜率為-11．2±0．6 mV(n=10)。鉗制電壓-140mV時(shí)，激活時(shí)間常數(shù)為0．66±0．1s：鉗制電壓-110mV時(shí)，激活時(shí)間常數(shù)為3．1±0．7s。IhHCN4的反轉(zhuǎn)電位

15、21．2±2．3mV(n=10)，PNa/PK為0．23。 2．鉗制電位-140mV，外液K+濃度30 mmol/L，Na+濃度由110 mmol/L降為50mmol/L，IhHCN4電流密度分別為-300±25pA/pF-1、-87±10 pA/pF-1，減少73％；外液Na+濃度110 mmol/L，K+濃度由30 mmol/L降為5 mmol/L，IhHCN4電流密度分別為-302±30 pA/pF-1、-244±19 p

16、A/pF-1，減少20％。 3．TTX和TEA灌流10min，對(duì)IhHCN4沒有影響。 4．1mmol/L cAMP灌流10min，IhHCN4無明顯變化，電極內(nèi)液中加入終濃度為1mmol/L的cAMP，IhHCN4激活加快，激活時(shí)間加快，V1/2由-109±2mV變?yōu)?92±2mV，向正向移動(dòng)17mV，激活閾值及最大激活電流沒有明顯改變 5．1μmol/L ISO灌流10min，IhHCN4略加快。1μmol/

17、L Ach灌流10min，IhHCN4無明顯改變。 6．低濃度Cs+可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用完全恢復(fù)，半效抑制濃度(IC50)為128．8±28．1μmol/L；較低濃度ZD7288可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用不能恢復(fù)，IC50為23．8±5．7μmol/L。 7．胺碘酮可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用無明顯恢復(fù)，IC50為1．34±0．33μmol/L；胺碘酮使各鉗制電壓下IhHCN4激活緩慢。