柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、魚尼丁受體（Ryanodine Receptor）是一類控制Ca2+從胞內(nèi)鈣庫向外釋放的配體門控鈣離子通道，主要在肌肉細(xì)胞的肌漿網(wǎng)和神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定具有不可替代的作用。哺乳動(dòng)物有3種不同類型的魚尼丁受體，包括RyR1、RyR2和RyR3。而昆蟲體內(nèi)只存在1個(gè)編碼魚尼丁受體的基因，且在氨基酸水平上與哺乳動(dòng)物3種同工型魚尼丁受體的同源性均不高于50％，這為研制對(duì)人畜低毒而對(duì)害蟲高效的化學(xué)藥劑提供了可能。柑

2、桔粉虱和褐色桔蚜均屬半翅目柑桔害蟲。近年來，由于桔園品種種植單一、化學(xué)農(nóng)藥過度使用甚至濫用，大量桔園害蟲的天敵被殺死，造成生態(tài)系統(tǒng)失去平衡，害蟲抗藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重。因此，以魚尼丁受體為作用靶標(biāo)的雙酰胺類殺蟲劑逐漸成為研究的熱點(diǎn)。據(jù)此，本學(xué)位論文針對(duì)柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體及其選擇性剪接進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究工作，旨在為研制出以該基因?yàn)樽饔冒袠?biāo)的高效、安全殺蟲劑提供理論基礎(chǔ)。本論文主要研究結(jié)果如下：
　　1.柑桔粉虱和褐色桔蚜對(duì)常

3、用殺蟲劑的敏感性測(cè)定
　　利用改進(jìn)后的濾紙藥膜法和玻片浸漬法，對(duì)采自學(xué)校網(wǎng)室的柑桔粉虱和褐色桔蚜對(duì)5種常用殺蟲劑（阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺、吡蟲啉、毒死蜱、高效氯氰菊酯）的敏感性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，5種藥劑對(duì)柑桔粉虱的毒殺作用由強(qiáng)到弱分別為阿維菌素、吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺、毒死蜱和高效氯氰菊酯，而對(duì)褐色桔蚜的毒殺作用由強(qiáng)到弱依次為吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺、毒死蜱、高效氯氰菊酯和阿維菌素。
　　2.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因的

4、克隆及結(jié)構(gòu)分析
　　基于柑桔粉虱和褐色桔蚜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分別克隆得到2種害蟲的魚尼丁受體基因DcRyR和TciRyR編碼完整開放閱讀框（ORF）的cDNA序列。其中，DcRyR的ORF長15,381bp，編碼5,126個(gè)氨基酸殘基，GenBank登錄號(hào)為KP733848，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為579.45KDa，等電點(diǎn)為5.49。TciRyR的ORF長15,315bp，編碼5,104個(gè)氨基酸殘

5、基，GenBank登錄號(hào)為KP733849，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為580.08kDa，等電點(diǎn)為5.49。
　　氨基酸序列分析表明，DcRyR和TciRyR與其他昆蟲魚尼丁受體的相似性介于70%-90%之間。其中，柑桔粉虱DcRyR與煙粉虱BtRyR氨基酸序列相似度最高，相似性為95.1%。褐色桔蚜TciRyR與桃蚜MpRyR、豌豆蚜ApRyR的親緣關(guān)系最近，相似性分別高達(dá)98.2%和98.1%。然而，DcRyR和TciRyR與哺乳動(dòng)物

6、的相似性僅在43%-46%之間。
　　對(duì)柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，DcRyR和TciRyR均具有許多魚尼丁受體重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，如SD結(jié)構(gòu)域、MIR（甘露糖轉(zhuǎn)移酶）結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RIH（RyR和IP3R同源）結(jié)構(gòu)域、3個(gè)SPRY（SPla和RyR）結(jié)構(gòu)域、4個(gè)RYR重復(fù)結(jié)構(gòu)域及RIH associated。在C末端均存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1-TM6），分別對(duì)應(yīng)6個(gè)高度疏水區(qū)域。此外，DcRyR和TciRy

7、R均存在EF-hands、pore helix和作為Ca2+釋放通道的孔道形成區(qū)域一部分的GXRXGGGXGD基序，且以上序列與其他已知的魚尼丁受體基因序列相似度極高?？偟膩碇v，DcRyR和TciRyR具有魚尼丁受體的全部典型結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有結(jié)構(gòu)上和功能上的保守性。
　　3.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因mRNA表達(dá)分析
　　熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DcRyR和TciRyR在2種害蟲不同發(fā)育階段和不同體段的樣品中均有所表

8、達(dá)。其中，DcRyR mRNA表達(dá)量在柑桔粉虱成蟲頭部和胸部顯著高于腹部，DcRyR mRNA的表達(dá)量在卵期最高而在若蟲期最低。TciRyR的表達(dá)量在褐色桔蚜成蟲期頭部高表達(dá)，在胸部和腹部的表達(dá)水平無顯著性差異。
　　4.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因選擇性剪接分析
　　通過對(duì)DcRyR多個(gè)cDNA克隆測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)DcRyR存在2種類型共4個(gè)選擇性剪接子，包括2個(gè)選擇性外顯子（AS1a和AS1d）和1對(duì)互斥外顯子（A

9、S1b和AS1c）。通過特異性PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以上4個(gè)外顯子在柑桔粉虱不同體段和不同發(fā)育階段的表達(dá)頻率存在差異。其中，AS1a(+)在柑桔粉虱成蟲胸部發(fā)生的頻率較高，AS1d(+)在若蟲期更容易發(fā)生。而AS1b/c作為互斥外顯子，AS1b在所有發(fā)育階段和體段的發(fā)生頻率均高于AS1c。同樣，通過對(duì)TciRyR多個(gè)cDNA克隆測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)TciRyR僅存在1個(gè)選擇性剪接位點(diǎn)（AS2），進(jìn)一步克隆其基因組序列，分析發(fā)現(xiàn)該選擇性剪接由內(nèi)含子

10、保留機(jī)制所致，并會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止。在對(duì)TciRyR選擇性外顯子的特異性PCR檢測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)AS2(-)在若蟲和成蟲以及成蟲頭部、胸部和腹部的表達(dá)頻率均顯著高于AS2(+)。
　　綜上所述，本學(xué)位論文對(duì)柑桔粉虱和褐色桔蚜校內(nèi)網(wǎng)室種群對(duì)常用殺蟲劑的敏感性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)；基于柑桔粉虱和褐色桔蚜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別克隆得到其魚尼丁受體基因DcRyR和TciRyR，分析了功能結(jié)構(gòu)區(qū)域特性；采用熒光定量PCR技術(shù)解析了這2個(gè)基因分別在2種