柑桔粉虱轉錄組分析及抗逆基因的鑒定研究.pdf

1、柑桔粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)是一種世界分布的害蟲，近幾年在中國柑桔產區(qū)的危害日益加重，然而對其研究卻相當滯后，目前尚未建立有效的針對柑桔粉虱的室內毒力測定的方法，而分子生物學的研究更是極少報道，如何開展柑桔粉虱的抗性監(jiān)測以及抗逆性分子機制的研究，是亟待解決的問題。隨著新一代高通量測序技術的出現(xiàn)和發(fā)展，在缺乏基因組信息的情況下，可以在轉錄組水平上獲得特定組織、器官和個體的基因信息及其表達情況，該技術在昆蟲學

2、的應用極大地推動了昆蟲分子生物學的研究。
　　本學位論文著眼于開展柑桔粉虱對幾種藥劑敏感性測定，利用高通量測序技術較為全面的獲取柑桔粉虱轉錄組信息，在基因注釋和表達模式解析的基礎上，篩選并鑒定主要抗逆基因，為殺蟲劑新靶標的開發(fā)以及藥劑代謝機理的研究奠定基礎;同時基于柑桔粉虱轉錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘其功能SSR，以期獲得可供其種群遺傳學研究所需的分子標記，以此為切入點，在分析文獻的基礎上，探討基于轉錄組數(shù)據(jù)庫發(fā)掘昆蟲微衛(wèi)星位點的前景和挑戰(zhàn)，

3、進而建立一套簡單有效的操作流程;主要研究結果如下:
　　1.初步建立了穩(wěn)定、高效的室內毒力測定方法——瓊脂保濕浸葉法。確定了柑桔粉虱對7種殺蟲劑的敏感性，這7種殺蟲劑的活性從高到低依次為阿維菌素＞氟蟲腈＞吡蟲啉＞多殺菌素＞高效氯氰菊酯＞毒死蜱＞丁硫克百威。
　　2.利用高通量測序技術對柑桔粉虱進行轉錄組測序，共獲得43075個轉錄本，總長度為23238374bp，平均長度為539bp;運用paired-end joining

4、和gap-filling技術進一步拼接得到36766個Unigene，其中包含的總堿基數(shù)為18282349 bp。將36766個Unigene提交至NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫(Nr)進行BLASTX比對，設置的閾值E為10-5，得到了16460個有效注釋結果。同時，利用其它數(shù)據(jù)庫如:Nt、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG及TrEMBL數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，分別獲得11458，14441，4850，5731，7507和16452個Un

5、igene。綜合所有數(shù)據(jù)庫比對結果，共17788條Unigene得到成功注釋。
　　3.將柑桔粉虱轉錄組Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫中多種昆蟲抗逆性相關基因（解毒代謝酶和熱激蛋白基因）進行比對，共鑒定出117個與解毒代謝相關的Unigene。它們包含了主要的解毒代謝酶類如谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)和細胞色素P450。通過系統(tǒng)發(fā)育分析得出，谷胱甘肽S-轉移酶分屬于Sigma、Delta、Epsilon、Om

6、ega家族，羧酸酯酶分屬于Clade A、Clade D和Clade E家族，細胞色素P450分屬于CYP4、CYP3和CYP2三個家族。此外，從柑桔粉虱轉錄組中共鑒定出67個熱激蛋白Unigene，它們主要編碼sHsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100，其數(shù)目分別是18、4、36、8和1個。抗逆性相關基因的挖掘和鑒定為后續(xù)其功能的研究提供了基礎數(shù)據(jù)。
　　4.通過生物信息學方法，從柑桔粉虱轉錄組數(shù)據(jù)庫中共篩選得