柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組分析及抗逆基因的鑒定研究.pdf

1、柑桔粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)是一種世界分布的害蟲，近幾年在中國(guó)柑桔產(chǎn)區(qū)的危害日益加重，然而對(duì)其研究卻相當(dāng)滯后，目前尚未建立有效的針對(duì)柑桔粉虱的室內(nèi)毒力測(cè)定的方法，而分子生物學(xué)的研究更是極少報(bào)道，如何開展柑桔粉虱的抗性監(jiān)測(cè)以及抗逆性分子機(jī)制的研究，是亟待解決的問題。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，在缺乏基因組信息的情況下，可以在轉(zhuǎn)錄組水平上獲得特定組織、器官和個(gè)體的基因信息及其表達(dá)情況，該技術(shù)在昆蟲學(xué)

2、的應(yīng)用極大地推動(dòng)了昆蟲分子生物學(xué)的研究。
　　本學(xué)位論文著眼于開展柑桔粉虱對(duì)幾種藥劑敏感性測(cè)定，利用高通量測(cè)序技術(shù)較為全面的獲取柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組信息，在基因注釋和表達(dá)模式解析的基礎(chǔ)上，篩選并鑒定主要抗逆基因，為殺蟲劑新靶標(biāo)的開發(fā)以及藥劑代謝機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ);同時(shí)基于柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘其功能SSR，以期獲得可供其種群遺傳學(xué)研究所需的分子標(biāo)記，以此為切入點(diǎn)，在分析文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，探討基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫發(fā)掘昆蟲微衛(wèi)星位點(diǎn)的前景和挑戰(zhàn)，

3、進(jìn)而建立一套簡(jiǎn)單有效的操作流程;主要研究結(jié)果如下:
　　1.初步建立了穩(wěn)定、高效的室內(nèi)毒力測(cè)定方法——瓊脂保濕浸葉法。確定了柑桔粉虱對(duì)7種殺蟲劑的敏感性，這7種殺蟲劑的活性從高到低依次為阿維菌素＞氟蟲腈＞吡蟲啉＞多殺菌素＞高效氯氰菊酯＞毒死蜱＞丁硫克百威。
　　2.利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)柑桔粉虱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得43075個(gè)轉(zhuǎn)錄本，總長(zhǎng)度為23238374bp，平均長(zhǎng)度為539bp;運(yùn)用paired-end joining

4、和gap-filling技術(shù)進(jìn)一步拼接得到36766個(gè)Unigene，其中包含的總堿基數(shù)為18282349 bp。將36766個(gè)Unigene提交至NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr)進(jìn)行BLASTX比對(duì)，設(shè)置的閾值E為10-5，得到了16460個(gè)有效注釋結(jié)果。同時(shí)，利用其它數(shù)據(jù)庫如:Nt、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG及TrEMBL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋，分別獲得11458，14441，4850，5731，7507和16452個(gè)Un

5、igene。綜合所有數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，共17788條Unigene得到成功注釋。
　　3.將柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫中多種昆蟲抗逆性相關(guān)基因（解毒代謝酶和熱激蛋白基因）進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出117個(gè)與解毒代謝相關(guān)的Unigene。它們包含了主要的解毒代謝酶類如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)和細(xì)胞色素P450。通過系統(tǒng)發(fā)育分析得出，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶分屬于Sigma、Delta、Epsilon、Om

6、ega家族，羧酸酯酶分屬于Clade A、Clade D和Clade E家族，細(xì)胞色素P450分屬于CYP4、CYP3和CYP2三個(gè)家族。此外，從柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出67個(gè)熱激蛋白Unigene，它們主要編碼sHsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100，其數(shù)目分別是18、4、36、8和1個(gè)?？鼓嫘韵嚓P(guān)基因的挖掘和鑒定為后續(xù)其功能的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　4.通過生物信息學(xué)方法，從柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共篩選得