成花調(diào)控基因LFY的選擇性剪接及其功能研究.pdf

1、開花過程（即成花）在相當(dāng)?shù)某潭壬蠜Q定著繁育是否成功，是高等植物最關(guān)鍵的生命時(shí)期之一，近年來已成為植物生殖發(fā)育研究的新熱點(diǎn)，并且該領(lǐng)域的研究對(duì)農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)有著重要意義。其中，LEY基因是目前研究得比較深入的成花相關(guān)基因之一。LFY基因作為花分生組織特性基因，被認(rèn)為是很多植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的主要調(diào)控因子之一。
　　 真核生物基因的選擇性剪接極大地豐富了基因表達(dá)產(chǎn)物的多樣性和基因表達(dá)的復(fù)雜程度。選擇性剪接改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、

2、活性、定位，及影響蛋白質(zhì)亞基或蛋白質(zhì)間的互作、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，甚至產(chǎn)生無功能的產(chǎn)物。其在調(diào)控植物生長、發(fā)育、遺傳、免疫及抗性等方面的作用已越來越為研究者們所關(guān)注。而成花過程則恰恰是選擇性剪接等調(diào)控機(jī)制的有機(jī)組合和協(xié)調(diào)作用，因此，成花過程中涉及的選擇性剪接成為一個(gè)重要的研究部分。
　　 本研究進(jìn)行了成花調(diào)控基因LFY的表達(dá)分析，及其可能的選擇性剪接研究，并通過基因轉(zhuǎn)移，對(duì)較少報(bào)道的LFY基因選擇性剪接產(chǎn)物（1275bp片段）進(jìn)行一定的

3、功能驗(yàn)證。意在研究LFY基因發(fā)生的可變剪接事件及其對(duì)LFY基因功能的影響。研究結(jié)果如下：
　　 1.用RT-PCR法克隆了LFY基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本cDNA，即1263bp片段和1275bp片段。序列分析結(jié)果表明，1263bp片段包含了完整的編碼序列。1275bp片段除包含除完整的編碼序列外，在第一外顯子和第二外顯子間還保留了第一內(nèi)含子3’末端12bp序列。
　　 2.用RT-PCR法克隆了LFY基因發(fā)生可變剪接部位的三個(gè)片

4、段：LFY1239，LFY1263和LFY1275，分別代表了存在的三種可變剪接轉(zhuǎn)錄本。在營養(yǎng)生長期擬南芥蓮座葉中包含了三種，而在開花期的花器官和蓮座葉中只包含兩種（LFY1263，LFY1275）。序列比對(duì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄本LFY1239缺失了第一外顯子靠近3’端的36bp片段可能導(dǎo)致LFY蛋白質(zhì)在N末端缺失GTHHALDALSQE這12個(gè)氨基酸殘基而喪失活性，成為一個(gè)無功能的表達(dá)產(chǎn)物；轉(zhuǎn)錄本LFY1263包含從起始密碼到終止密碼的全部

5、開放閱讀框序列；轉(zhuǎn)錄本LFY1275在第一外顯子和第二外顯子間保留了第一內(nèi)含子的3’端12bp片段。
　　 3.通過高濃度（3.5％）的瓊脂糖凝膠電泳分離，并利用BioSpectrum ImagingSystem自帶的VisionWorks LS軟件對(duì)電泳照片進(jìn)行光密度分析。結(jié)果顯示LFY基因三種不同轉(zhuǎn)錄本在擬南芥不同生長發(fā)育階段其相對(duì)含量有所差異。表現(xiàn)為，LFY1263在三個(gè)分子中所占比例最大，結(jié)合已報(bào)道的證據(jù)，該轉(zhuǎn)錄本對(duì)開花

6、誘導(dǎo)有著重要意義。LFY1239只在營養(yǎng)生長期的蓮座葉被檢測(cè)到，并且編碼序列存在一定缺失，這是否提示其對(duì)擬南芥成花誘導(dǎo)作用不大? LFY1275和LFY1263在營養(yǎng)生長期和開花期均存在，兩轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)期蓮座葉中的相對(duì)比例較穩(wěn)定，在花器官中LFY1275相對(duì)于LFY1263的比例卻有所增加。但是，轉(zhuǎn)錄本LFY1275和LFY1263在擬南芥的生長發(fā)育和開花誘導(dǎo)過程中，是獨(dú)立作用還是協(xié)同作用，還需要深入的研究。
　　 4.用LF

7、Y1275 cDNA構(gòu)建了植物組成型表達(dá)載體pBL1275，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株，并浸染多頭切花菊“綠寶石”品種無菌苗莖段材料，初步獲得了17株Kan抗性苗，其中PCR檢測(cè)陽性為9株，占抗性苗的52.94％。利用RT-PCR檢測(cè)了移栽2個(gè)月后的9株P(guān)CR陽性苗，其中7株為RT-PCR陽性，表明LFY1275能夠在轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)。
　　 5.與未轉(zhuǎn)化植株相比，移栽的轉(zhuǎn)基因植株長勢(shì)較弱。部分植株出現(xiàn)分枝的主莖、側(cè)芽的提早分