人白細胞介素22的克隆表達及功能研究.pdf

1、白細胞介素-22(IL-22)是于2000年發(fā)現(xiàn)的由激活的T細胞分泌的細胞因子，屬于IL-10家族。功能性IL-22受體復(fù)合物由IL-22R1和IL-10R2兩條受體鏈組成，IL-22通過與兩條受體鏈的結(jié)合，激活受體復(fù)合物介導(dǎo)的多重信號途徑，包括Januskinase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白(STAT)的激活劑及在肝細胞被激活的促有絲分裂蛋白激酶途徑。而與其中一個受體單獨結(jié)合時，IL-22不能介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在功能方面，IL-22

2、可以上調(diào)肝急性期蛋白表達和胰腺相關(guān)蛋白PAP1/Reg2和OPN的高表達，表明IL-22在炎癥反應(yīng)中起作用；在腸上皮細胞、肺上皮細胞、神經(jīng)元細胞、腎小球系膜細胞、肝細胞及黑素瘤細胞中，IL-22能激活STAT轉(zhuǎn)錄因子。它對伴刀豆球蛋白(ConA)刺激下Th2細胞的IL-4的分泌有一定的抑制作用，這對于哮喘也有潛在的治療作用。近期研究表明，IL-22是肝細胞的一個存活因子，激活的T細胞通過釋放IL-22也可以預(yù)防和修復(fù)肝損傷。 本

3、研究從CD3抗體和ConA共刺激的人外周血白細胞中提取總RNA，利用RT-PCR方法擴增得到了不含信號肽的hIL-22的基因。然后，將hIL-22基因插入pBV220載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV-IL22。同時為了嘗試可溶性表達hIL-22，我們將目的基因插入pET-17b載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-IL22。將pBV-IL22分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、JM109、HB101，將pET-IL22轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選出陽性轉(zhuǎn)化菌落獲

4、得相應(yīng)工程菌株，結(jié)果表明hIL-22在大腸桿菌HB101中表達量最高，可達菌體總蛋白的40％以上。目的蛋白在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)洗滌后以Sephacryl-300凝膠柱層析純化，目的蛋白的純度可達90％以上。純化蛋白在還原型和氧化型谷胱甘肽組成的氧化還原體系中進行復(fù)性，PEG20000濃縮，獲得了具有活性的hIL-22的純品。MTT法檢測到hIL-22對HepG2細胞有明顯的促增殖作用。利用半定量RT-PCR方

5、法初步探討了IL-22體外刺激人肝癌細胞HepG2、正常人肝細胞LO2表達c-myc和bcl-2的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-22促進LO2細胞中c-myc和bcl-2的表達，促進HepG2細胞中c-myc的表達。通過建立了小鼠肝損傷模型，我們初步探討了IL-22對肝臟的保護和修復(fù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷血清ALT和AST明顯升高并誘導(dǎo)肝點狀壞死，而保護組預(yù)先注射重組IL-22的小鼠幾乎完全阻止了血清ALT和AST升高及Co