流體剪應(yīng)力作用下成骨細胞的響應(yīng)及其OPG、ODF表達的研究.pdf

1、本研究以Wistar大鼠顱骨成骨細胞為研究對象，通過流動腔裝置施以流體剪應(yīng)力，從細胞的增殖、分化、礦化和形變研究成骨細胞對流體剪應(yīng)力的響應(yīng)，從骨保護因子(OPG)，破骨細胞分化因子(ODF)的基因表達研究力學刺激對骨吸收和骨形成平衡的調(diào)控，最后嘗試成骨細胞對破骨細胞形成的誘導作用，進一步考察了力學刺激影響骨代謝平衡的可能途徑。 主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 設(shè)計加工了對單層細胞施以流體剪應(yīng)力的流動腔裝置。該裝置能夠提供充分發(fā)散的

2、層流態(tài)流體，通過流量控制調(diào)節(jié)剪應(yīng)力的大小。整套裝置組裝簡便，受試細胞量大(1×105個)，所需灌流液可控制在10ml以內(nèi)，能夠?qū)毎M行有效的剪應(yīng)力刺激，研究表明能滿足對各項生化指標的檢測。 運用組織塊法培養(yǎng)了大鼠乳鼠顱骨成骨細胞，并利用差異貼壁法對其進行有效純化。通過形態(tài)觀察、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測、Von Kossa染色鑒定表明具有成骨細胞的典型生物學行為。細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)至第三代用于后續(xù)力學實驗。 對成骨細胞

3、施加5、10、20、30 dynes/cm2四個水平的流體剪應(yīng)力，每個水平的力分別作用3，6，12，24，36h。加載結(jié)束，受試細胞做流式細胞儀檢測細胞周期，計算增殖指數(shù)(PI)衡量細胞增殖能力的變化。細胞形態(tài)變化通過顯微鏡形態(tài)觀察和FITC－鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin)細胞骨架熒光染色來觀察。結(jié)果顯示，5，10 dynes/cm2的剪應(yīng)力具有促進細胞增殖的作用，作用12h細胞的增殖指數(shù)分別提高了20.2％和45.7％，并

4、且細胞形態(tài)沿流體流動的方向被拉長，細胞骨架熒光染色顯示，骨架發(fā)生重排。本實驗中20，30 dynes/cm2的剪應(yīng)力抑制了細胞的增殖，作用12h，分別降低了72.6％和76.3％。 對成骨細胞施加5、10、20、30 dynes/cm2四個水平的流體剪應(yīng)力，每個水平的力分別作用3，6，12，24，36h。檢測成骨細胞ALP活性和胞外鈣分泌的變化。結(jié)果顯示，剪應(yīng)力作用下ALP的活性從高到低依次是10>20>5>0>30 dynes

5、/cm2，同時10，20 dynes/cm2在提高ALP活性的同時，還使ALP活性高峰期相對于對照組提前3h。剪應(yīng)力作用下鈣分泌從高到低依次是10>5>20>0>30 dynes/cm2，鈣分泌的時間分布未受影響，只是分泌量受到調(diào)節(jié)。由此認為，適當?shù)募魬?yīng)力(如5~20 dynes/cm2)作用能夠促進成骨細胞的分化成熟，以及礦化基質(zhì)的形成。 對成骨細胞施以5、10、15 dynes/cm2單一水平的流體剪應(yīng)力作用24h，以及5、

6、10、15 dynes/cm2梯度增加和15、10、5 dynes/cm2梯度減少的剪應(yīng)力，梯度時間間隔為8小時，總作用時間作用為24h，采用RT-PCR檢測成骨細胞OPG、ODF mRNA的表達狀況。結(jié)果顯示，OPG和ODF mRNA的表達均能受到剪應(yīng)力作用的影響。與靜態(tài)相比，10 dynes/cm2剪應(yīng)力作用能促進OPG mRNA的表達，抑制了靜態(tài)下表達逐步降低的趨勢，同時顯著抑制了ODF mRNA的表達，并且抑制作用隨作用時間的延

7、長逐步加強。比較相同時間下(24h)不同水平的剪應(yīng)力作用，以及單一加載和梯度加載的效果發(fā)現(xiàn)，10、15 dynes/cm2作用效果最為明顯，5 dynes/cm2次之。梯度增加的加載方式與10、15 dynes/cm2單一加載方式?jīng)]有顯著差異，梯度減少的加載方式與5 dynes/cm2單一加載也沒有顯著差異，因此認為梯度加載的過程中后一水平的剪應(yīng)力作用掩蓋了前一水平的剪應(yīng)力作用效果，也可以認為剪應(yīng)力的作用提高了成骨細胞對剪應(yīng)力響應(yīng)的速度

8、，即同一水平的剪應(yīng)力在梯度加載下加載8h的效果與單一加載24h的效果相當?？傊魬?yīng)力作用使得OPG/ODF mRNA的平衡向著OPG占優(yōu)的方向變化，這種變化意味著骨吸收會受到抑制。 以骨髓單核細胞作為破骨細胞前體細胞，嘗試剪應(yīng)力作用下成骨細胞誘導破骨細胞生成。結(jié)果顯示，以成骨細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓單核細胞能明顯提高細胞的存活率，改善生長狀態(tài)。實驗中形成的多核細胞的數(shù)量反映，剪應(yīng)力作用下的成骨細胞誘導細胞融合的效果不如靜態(tài)培養(yǎng)下的