流體剪應力-材料表面化學共刺激對成骨細胞早期行為的影響.pdf

1、因交通事故、運動損傷、老齡化、生殖缺陷或疾病等導致每年有大量人群的骨組織受損，甚至缺失。組織工程為有效修復受損骨組織提供了可能。種子細胞和支架是組織工程的兩個核心組成部分。成骨細胞是骨組織工程典型的種子細胞，支架作為一種人工胞外基質，在為成骨細胞提供物理支撐的同時也為成骨細胞提供生長的微環(huán)境。支架材料的結構（包括化學結構、表面拓撲結構以及空間幾何結構）調(diào)控成骨細胞的生命行為。同時，成骨細胞作為一種力敏感細胞，還需要接受合適的力學刺激才可

2、能形成具有正常生理功能的骨組織。因此，支架和力學刺激共同構成了成骨細胞體外生化反應器的重要組成部分，二者共同調(diào)控成骨細胞行為，決定骨組織工程的成敗。研究支架結構和力學因素共刺激對成骨細胞行為的影響對于設計和制造有利于形成功能性骨組織的支架材料和生化反應器有重要的指導意義。
　　關于單獨的支架結構或單獨的力學刺激對成骨細胞行為的影響及其影響機制的研究報道已很多，但迄今卻鮮見關于支架結構和力學刺激的共同作用對成骨細胞行為影響及其影響機

3、制的報道。考慮到支架表面化學是最重要的支架結構信息之一，流體剪應力（FSS）是在體骨組織中最主要的力學刺激，本論文考查了支架表面化學和FSS共刺激對成骨細胞早期行為（FSS敏感因子 ATP、NO、PGE2釋放、早期增殖和早期分化）的影響及影響機制。黏著斑形成和細胞骨架形態(tài)都參與了材料表面化學和FSS影響成骨細胞行為的調(diào)控機制。因此，本論文還考查了表面化學-FSS共刺激之后黏著斑和細胞骨架形態(tài)變化及其與細胞早期行為之間的關系，并驗證了有關

4、共刺激機制的核心假設：黏著斑和細胞骨架是材料表面化學和流體剪應力共刺激調(diào)控成骨細胞行為的關鍵結構，材料表面化學通過調(diào)控成骨細胞黏著斑和細胞骨架結構來調(diào)控成骨細胞對流體剪應力的響應。主要的研究內(nèi)容和所取得的結果如下：
　?。?）利用硅烷化自組裝技術在組織培養(yǎng)載玻片表面（Glass）構建 OH、NH2和CH3表面，水接觸角和X射線光電子能譜（XPS）分析表明已成功制得 CH3、OH、NH2表面；構建了基于平行板流動腔的 FSS加載裝置

5、；將成骨細胞接種在不同化學表面后置于平行板流動腔中，施加不同大小的 FSS，從而成功構建了表面化學-FSS共刺激平臺，為后續(xù)共刺激研究奠定了基礎。
　?。?）考查了單獨表面化學刺激對成骨細胞黏著斑形成與F-actin骨架形態(tài)的影響，以及對細胞早期增殖潛能（PI）、堿性磷酸酶（ALP）活性和化學因子（ATP、NO、PGE2）釋放的影響，相關結果為后續(xù)共刺激研究提供對照。結果表明，NH2刺激使成骨細胞 F-actin纖維束粗壯、黏著斑

6、數(shù)量多且尺寸大，而 CH3和OH刺激使成骨細胞 F-actin組織和黏著斑結構疏松，呈現(xiàn)化學依賴性 NH2(>Glass)>OH≈CH3；與Glass表面相比，NH2表面明顯促進而CH3和OH表面明顯抑制成骨細胞早期增殖和分化；表面化學對ATP和NO的釋放沒有顯著影響，但對PGE2釋放有影響。
　?。?）考查了表面化學與不同大小 FSS共刺激對成骨細胞化學因子（ATP、NO和PGE2）釋放、增殖潛能、ALP活性，和細胞粘附的影響。

7、
　　①低流體剪應力（5 dynes/cm2，低于骨組織生理 FSS，記為 LFSS）與材料表面化學共同刺激：與單純的表面化學刺激相比，LFSS明顯提高 CH3和OH表面成骨細胞的化學因子釋放和增殖潛力，而對 Glass和NH2表面的成骨細胞沒有顯著影響；LFSS明顯提高了CH3和OH表面成骨細胞的取向性或細胞鋪展狀態(tài)，而對 NH2和Glass表面成骨細胞沒有影響。結合 LFSS刺激前（單獨表面化學刺激）各化學表面上成骨細胞的 F

8、-actin骨架和黏著斑狀態(tài)，提示其可能機制是表面化學刺激通過影響成骨細胞黏著斑形成和F-actin骨架形態(tài)，導致CH3和OH表面上成骨細胞對 LFSS的敏感性高，而 NH2表面上成骨細胞對 LFSS的敏感性低。就 FSS敏感性而言，在LFSS環(huán)境中，CH3和OH是合適的骨組織工程支架表面化學結構。
　?、谏砹黧w剪應力（12 dynes/cm2，最佳骨組織生理FSS，記為PFSS）與材料表面化學共同刺激：與單純的表面化學刺激相比

9、，PFSS明顯提高所有化學表面成骨細胞的化學因子釋放和早期增殖，且具有明顯的表面化學依賴性 NH2-PFSS(>Glass-PFSS)> OH-PFSS≈ CH3-PFSS；PFSS使所有化學表面成骨細胞的取向或形態(tài)都發(fā)生了改變。結合 PFSS刺激前（單獨表面化學刺激）各化學表面上成骨細胞的F-actin骨架和黏著斑狀態(tài)，提示細胞黏著斑和F-actin骨架在表面化學-PFSS共刺激調(diào)控成骨細胞行為中有重要作用。在PFSS環(huán)境中，NH2是

10、最合適的骨組織工程支架表面結構。
　　③高流體剪應力（20 dynes/cm2，高于最佳骨組織生理FSS，記為HFSS）與材料表面化學共同刺激：CH3和OH表面成骨細胞不能承受 HFSS刺激，發(fā)生明顯的脫落和細胞膜破裂現(xiàn)象，而 NH2表面細胞能夠承受 HFSS的刺激，并沿HFSS發(fā)生明顯的細胞取向。與單純的表面化學刺激相比，HFSS明顯促進NH2表面成骨細胞的化學因子釋放，并顯著提高細胞增殖潛能。上述結果提示，在HFSS環(huán)境中，C

11、H3、OH或 CH3/OH混合結構不適合用作骨組織工程支架的表面化學結構，而NH2是合適的表面化學結構。
　?。?）系統(tǒng)分析了不同大小 FSS（LFSS、PFSS、HFSS）與材料表面化學共刺激對成骨細胞早期行為的影響，并結合黏著斑抑制和F-actin細胞骨架阻斷實驗結果解析了表面化學-FSS共刺激對成骨細胞行為的調(diào)控機制。
　?、偻ㄟ^引入 FSS響應閥值（細胞能感受到的最低 FSS）、破壞閥值（使細胞脫落或細胞膜破裂的最低

12、 FSS）和最佳閥值（使細胞具有最佳響應的 FSS）這三個概念，系統(tǒng)分析了不同大小 FSS（LFSS、PFSS、HFSS）與表面化學共刺激對成骨細胞早期行為的影響。與Glass相比，CH3和OH表面明顯下調(diào)而 NH2明顯上調(diào)成骨細胞的FSS響應閥值和破壞閥值。CH3和OH表面細胞的FSS響應閥值低于5 dynes/cm2，破壞閥值介于12-20 dynes/cm2；而NH2表面細胞的響應閥值介于5-12 dynes/cm2，破壞閥值高于

13、20 dynes/cm2。FSS響應閥值和破壞閥值對表面化學的依賴性與不同化學表面上成骨細胞的黏著斑和F-actin骨架狀態(tài)密切相關。
　?、诓捎肦GDS抑制黏著斑形成后再施加PFSS刺激，各化學表面成骨細胞的PGE2釋放大幅度降低，且不再具有表面化學依賴性；ATP和NO釋放有一定程度的降低，提示FSS介導的PGE2釋放依賴于黏著斑，這與文獻報導是一致的。
　　③采用細胞松弛素B阻斷F-actin后施加PFSS刺激，各化學表

14、面成骨細胞的NO釋放量大幅度降低，且不再具有表面化學依賴性；ATP和PGE2釋放量有一定程度的降低，提示NO釋放依賴于完整的細胞骨架，這與文獻報道是一致的。
　?、芡瑫r抑制黏著斑形成和阻斷 F-actin后施加 PFSS，所有化學表面成骨細胞幾乎都不再釋放ATP、NO和PGE2。
　　⑤當成骨細胞黏著斑和F-actin同時被損以后，表面化學不再影響細胞對PFSS的響應，細胞對 PFSS也不再產(chǎn)生響應。結合前述表面化學和不同大