流體剪應(yīng)力-材料表面化學(xué)共刺激對成骨細(xì)胞早期行為的影響.pdf

1、因交通事故、運(yùn)動(dòng)損傷、老齡化、生殖缺陷或疾病等導(dǎo)致每年有大量人群的骨組織受損，甚至缺失。組織工程為有效修復(fù)受損骨組織提供了可能。種子細(xì)胞和支架是組織工程的兩個(gè)核心組成部分。成骨細(xì)胞是骨組織工程典型的種子細(xì)胞，支架作為一種人工胞外基質(zhì)，在為成骨細(xì)胞提供物理支撐的同時(shí)也為成骨細(xì)胞提供生長的微環(huán)境。支架材料的結(jié)構(gòu)（包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及空間幾何結(jié)構(gòu)）調(diào)控成骨細(xì)胞的生命行為。同時(shí)，成骨細(xì)胞作為一種力敏感細(xì)胞，還需要接受合適的力學(xué)刺激才可

2、能形成具有正常生理功能的骨組織。因此，支架和力學(xué)刺激共同構(gòu)成了成骨細(xì)胞體外生化反應(yīng)器的重要組成部分，二者共同調(diào)控成骨細(xì)胞行為，決定骨組織工程的成敗。研究支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)因素共刺激對成骨細(xì)胞行為的影響對于設(shè)計(jì)和制造有利于形成功能性骨組織的支架材料和生化反應(yīng)器有重要的指導(dǎo)意義。
　　關(guān)于單獨(dú)的支架結(jié)構(gòu)或單獨(dú)的力學(xué)刺激對成骨細(xì)胞行為的影響及其影響機(jī)制的研究報(bào)道已很多，但迄今卻鮮見關(guān)于支架結(jié)構(gòu)和力學(xué)刺激的共同作用對成骨細(xì)胞行為影響及其影響機(jī)

3、制的報(bào)道?？紤]到支架表面化學(xué)是最重要的支架結(jié)構(gòu)信息之一，流體剪應(yīng)力（FSS）是在體骨組織中最主要的力學(xué)刺激，本論文考查了支架表面化學(xué)和FSS共刺激對成骨細(xì)胞早期行為（FSS敏感因子 ATP、NO、PGE2釋放、早期增殖和早期分化）的影響及影響機(jī)制。黏著斑形成和細(xì)胞骨架形態(tài)都參與了材料表面化學(xué)和FSS影響成骨細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。因此，本論文還考查了表面化學(xué)-FSS共刺激之后黏著斑和細(xì)胞骨架形態(tài)變化及其與細(xì)胞早期行為之間的關(guān)系，并驗(yàn)證了有關(guān)

4、共刺激機(jī)制的核心假設(shè)：黏著斑和細(xì)胞骨架是材料表面化學(xué)和流體剪應(yīng)力共刺激調(diào)控成骨細(xì)胞行為的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，材料表面化學(xué)通過調(diào)控成骨細(xì)胞黏著斑和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)來調(diào)控成骨細(xì)胞對流體剪應(yīng)力的響應(yīng)。主要的研究內(nèi)容和所取得的結(jié)果如下：
　?。?）利用硅烷化自組裝技術(shù)在組織培養(yǎng)載玻片表面（Glass）構(gòu)建 OH、NH2和CH3表面，水接觸角和X射線光電子能譜（XPS）分析表明已成功制得 CH3、OH、NH2表面；構(gòu)建了基于平行板流動(dòng)腔的 FSS加載裝置

5、；將成骨細(xì)胞接種在不同化學(xué)表面后置于平行板流動(dòng)腔中，施加不同大小的 FSS，從而成功構(gòu)建了表面化學(xué)-FSS共刺激平臺(tái)，為后續(xù)共刺激研究奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）考查了單獨(dú)表面化學(xué)刺激對成骨細(xì)胞黏著斑形成與F-actin骨架形態(tài)的影響，以及對細(xì)胞早期增殖潛能（PI）、堿性磷酸酶（ALP）活性和化學(xué)因子（ATP、NO、PGE2）釋放的影響，相關(guān)結(jié)果為后續(xù)共刺激研究提供對照。結(jié)果表明，NH2刺激使成骨細(xì)胞 F-actin纖維束粗壯、黏著斑

6、數(shù)量多且尺寸大，而 CH3和OH刺激使成骨細(xì)胞 F-actin組織和黏著斑結(jié)構(gòu)疏松，呈現(xiàn)化學(xué)依賴性 NH2(>Glass)>OH≈CH3；與Glass表面相比，NH2表面明顯促進(jìn)而CH3和OH表面明顯抑制成骨細(xì)胞早期增殖和分化；表面化學(xué)對ATP和NO的釋放沒有顯著影響，但對PGE2釋放有影響。
　?。?）考查了表面化學(xué)與不同大小 FSS共刺激對成骨細(xì)胞化學(xué)因子（ATP、NO和PGE2）釋放、增殖潛能、ALP活性，和細(xì)胞粘附的影響。

7、
　　①低流體剪應(yīng)力（5 dynes/cm2，低于骨組織生理 FSS，記為 LFSS）與材料表面化學(xué)共同刺激：與單純的表面化學(xué)刺激相比，LFSS明顯提高 CH3和OH表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放和增殖潛力，而對 Glass和NH2表面的成骨細(xì)胞沒有顯著影響；LFSS明顯提高了CH3和OH表面成骨細(xì)胞的取向性或細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)，而對 NH2和Glass表面成骨細(xì)胞沒有影響。結(jié)合 LFSS刺激前（單獨(dú)表面化學(xué)刺激）各化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的 F

8、-actin骨架和黏著斑狀態(tài)，提示其可能機(jī)制是表面化學(xué)刺激通過影響成骨細(xì)胞黏著斑形成和F-actin骨架形態(tài)，導(dǎo)致CH3和OH表面上成骨細(xì)胞對 LFSS的敏感性高，而 NH2表面上成骨細(xì)胞對 LFSS的敏感性低。就 FSS敏感性而言，在LFSS環(huán)境中，CH3和OH是合適的骨組織工程支架表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　②生理流體剪應(yīng)力（12 dynes/cm2，最佳骨組織生理FSS，記為PFSS）與材料表面化學(xué)共同刺激：與單純的表面化學(xué)刺激相比

9、，PFSS明顯提高所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放和早期增殖，且具有明顯的表面化學(xué)依賴性 NH2-PFSS(>Glass-PFSS)> OH-PFSS≈ CH3-PFSS；PFSS使所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞的取向或形態(tài)都發(fā)生了改變。結(jié)合 PFSS刺激前（單獨(dú)表面化學(xué)刺激）各化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的F-actin骨架和黏著斑狀態(tài)，提示細(xì)胞黏著斑和F-actin骨架在表面化學(xué)-PFSS共刺激調(diào)控成骨細(xì)胞行為中有重要作用。在PFSS環(huán)境中，NH2是

10、最合適的骨組織工程支架表面結(jié)構(gòu)。
　?、鄹吡黧w剪應(yīng)力（20 dynes/cm2，高于最佳骨組織生理FSS，記為HFSS）與材料表面化學(xué)共同刺激：CH3和OH表面成骨細(xì)胞不能承受 HFSS刺激，發(fā)生明顯的脫落和細(xì)胞膜破裂現(xiàn)象，而 NH2表面細(xì)胞能夠承受 HFSS的刺激，并沿HFSS發(fā)生明顯的細(xì)胞取向。與單純的表面化學(xué)刺激相比，HFSS明顯促進(jìn)NH2表面成骨細(xì)胞的化學(xué)因子釋放，并顯著提高細(xì)胞增殖潛能。上述結(jié)果提示，在HFSS環(huán)境中，C

11、H3、OH或 CH3/OH混合結(jié)構(gòu)不適合用作骨組織工程支架的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)，而NH2是合適的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　?。?）系統(tǒng)分析了不同大小 FSS（LFSS、PFSS、HFSS）與材料表面化學(xué)共刺激對成骨細(xì)胞早期行為的影響，并結(jié)合黏著斑抑制和F-actin細(xì)胞骨架阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析了表面化學(xué)-FSS共刺激對成骨細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。
　　①通過引入 FSS響應(yīng)閥值（細(xì)胞能感受到的最低 FSS）、破壞閥值（使細(xì)胞脫落或細(xì)胞膜破裂的最低

12、 FSS）和最佳閥值（使細(xì)胞具有最佳響應(yīng)的 FSS）這三個(gè)概念，系統(tǒng)分析了不同大小 FSS（LFSS、PFSS、HFSS）與表面化學(xué)共刺激對成骨細(xì)胞早期行為的影響。與Glass相比，CH3和OH表面明顯下調(diào)而 NH2明顯上調(diào)成骨細(xì)胞的FSS響應(yīng)閥值和破壞閥值。CH3和OH表面細(xì)胞的FSS響應(yīng)閥值低于5 dynes/cm2，破壞閥值介于12-20 dynes/cm2；而NH2表面細(xì)胞的響應(yīng)閥值介于5-12 dynes/cm2，破壞閥值高于

13、20 dynes/cm2。FSS響應(yīng)閥值和破壞閥值對表面化學(xué)的依賴性與不同化學(xué)表面上成骨細(xì)胞的黏著斑和F-actin骨架狀態(tài)密切相關(guān)。
　?、诓捎肦GDS抑制黏著斑形成后再施加PFSS刺激，各化學(xué)表面成骨細(xì)胞的PGE2釋放大幅度降低，且不再具有表面化學(xué)依賴性；ATP和NO釋放有一定程度的降低，提示FSS介導(dǎo)的PGE2釋放依賴于黏著斑，這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)是一致的。
　　③采用細(xì)胞松弛素B阻斷F-actin后施加PFSS刺激，各化學(xué)表

14、面成骨細(xì)胞的NO釋放量大幅度降低，且不再具有表面化學(xué)依賴性；ATP和PGE2釋放量有一定程度的降低，提示NO釋放依賴于完整的細(xì)胞骨架，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。
　?、芡瑫r(shí)抑制黏著斑形成和阻斷 F-actin后施加 PFSS，所有化學(xué)表面成骨細(xì)胞幾乎都不再釋放ATP、NO和PGE2。
　?、莓?dāng)成骨細(xì)胞黏著斑和F-actin同時(shí)被損以后，表面化學(xué)不再影響細(xì)胞對PFSS的響應(yīng)，細(xì)胞對 PFSS也不再產(chǎn)生響應(yīng)。結(jié)合前述表面化學(xué)和不同大