饑餓誘導(dǎo)環(huán)境下成骨細(xì)胞自噬與凋亡作用狀況的初步研究.pdf

1、在正畸治療的過(guò)程中,牙齒受到大小合適、方向適宜的正畸力后，壓力側(cè)牙槽骨中成骨細(xì)胞會(huì)大量死亡，破骨細(xì)胞增生，導(dǎo)致牙槽骨吸收；張力側(cè)成骨細(xì)胞增生，牙槽骨新骨形成，這種發(fā)生在牙槽骨的骨組織改建是正畸牙齒移動(dòng)的基礎(chǔ)。目前研究認(rèn)為，壓力側(cè)牙槽骨包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的骨細(xì)胞大量死亡，是因?yàn)檎ψ饔孟?，牙槽骨局部微環(huán)境發(fā)生了改變，這其中包括壓力側(cè)牙周膜壓縮變窄、提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣的毛細(xì)血管在正畸力作用下管腔變窄，循環(huán)受阻，血供減少，這就導(dǎo)致了壓力側(cè)牙槽骨組

2、織細(xì)胞處于一個(gè)低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏的饑餓環(huán)境，那么這種環(huán)境是如何造成牙槽骨吸收、壓力側(cè)牙槽骨細(xì)胞大量死亡的呢？細(xì)胞死亡的三種方式：壞死、自噬、凋亡，在適宜的正畸力作用下，牙槽骨改建屬于牙齒的生理性改建，骨組織不會(huì)發(fā)生細(xì)胞壞死等病理性改變，自噬與凋亡都屬于細(xì)胞自身主導(dǎo)的程序性死亡方式，他們都分別在壓力側(cè)骨組織細(xì)胞死亡的過(guò)程中扮演了什么樣的角色？相互關(guān)系如何？本研究針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)建立比格犬正畸牙齒移動(dòng)模型，在體研究分析了壓力側(cè)牙槽骨正畸改建過(guò)

3、程中自噬與凋亡表達(dá)水平的變化，并進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)觀察了成骨細(xì)胞在饑餓環(huán)境下自噬與凋亡表達(dá)水平的變化及相互關(guān)系，對(duì)壓力側(cè)骨組織細(xì)胞的消亡關(guān)系進(jìn)行了初步研究。本課題研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)方面：
　　1．牙齒移動(dòng)過(guò)程中牙槽骨組織細(xì)胞自噬與凋亡水平變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：建立比格犬正畸牙齒移動(dòng)模型，檢測(cè)在正畸力作用下，壓力側(cè)牙槽骨組織形態(tài)學(xué)變化和骨組織細(xì)胞中自噬與凋亡的表達(dá)情況。
　　方法：將6只成年比格犬的24顆尖

4、牙隨機(jī)分為空白對(duì)照組、正畸加力組?？瞻讓?duì)照組無(wú)任何處理，正畸加力組牙齒以種植釘為支抗，以150g正畸力遠(yuǎn)中移動(dòng)尖牙，建立比格犬尖牙遠(yuǎn)中移動(dòng)模型，按正畸力作用時(shí)間分為正畸加力7天組、14天組、28天組。觀察正畸力作用下牙齒移動(dòng)效果，通過(guò)HE方法分析其壓力側(cè)骨組織改建情況，利用免疫組化染色及Western blot方法，分析壓力側(cè)牙槽骨組織中自噬與凋亡的作用情況。
　　結(jié)果：比格犬尖牙在正畸力作用下，①和空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組尖牙遠(yuǎn)

5、中移動(dòng)明顯（P<0.05），牙齒在正畸力作用下，隨作用時(shí)間的增加移動(dòng)距離不斷增長(zhǎng)（P<0.05）；②Western blot顯示與空白對(duì)照組相比，壓力側(cè)牙槽骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化率迅速上升，7天到達(dá)頂峰（P<0.05），caspase3蛋白表達(dá)水平7天后迅速升高，28天到達(dá)頂峰（P<0.05）；③HE結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，壓力側(cè)牙槽骨組織隨著正畸力作用時(shí)間的延長(zhǎng)吸收情況不斷加重；④免疫組化染色結(jié)果顯示加力7天組和28天組

6、的LC3染色為陽(yáng)性，caspase3染色在正畸加力14天組和加力28天組為陽(yáng)性。
　　結(jié)論：適宜的矯治力持續(xù)作用下，壓力側(cè)牙槽骨組織骨細(xì)胞早期出現(xiàn)自噬反應(yīng)增強(qiáng)的現(xiàn)象，此時(shí)骨吸收現(xiàn)象不明顯；隨著矯治力持續(xù)作用，自噬減弱，凋亡開始出現(xiàn)，骨吸收程度也不斷加重。這一結(jié)果提示，壓力側(cè)牙槽骨組織骨細(xì)胞早期出現(xiàn)自噬反應(yīng)增強(qiáng)可能是一種組織保護(hù)機(jī)制，可以延遲凋亡作用的出現(xiàn)。
　　2．饑餓誘導(dǎo)環(huán)境下小鼠成骨細(xì)胞自噬與凋亡相互作用的實(shí)驗(yàn)研究

7、>　　目的：探討?zhàn)囸I條件下自噬與凋亡在小鼠成骨細(xì)胞中的發(fā)生情況與相互關(guān)系。
　　方法：培養(yǎng)初代MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系，將其分為饑餓誘導(dǎo)組與3-甲基腺素（3-MA）預(yù)處理饑餓誘導(dǎo)組。其中，饑餓誘導(dǎo)組采用單純饑餓誘導(dǎo)法，用厄爾氏平衡鹽溶液（earle’s balanced salt solution，EBSS）培養(yǎng)1h、2h、3h、4h、5h、6h。3-MA是一種特異性自噬抑制劑，在3-MA預(yù)處理饑餓誘導(dǎo)組中，正常培養(yǎng)的小鼠成

8、骨細(xì)胞加入3-MA預(yù)處理1h后，再用EBSS平衡鹽溶液培養(yǎng)1h、2h、3h、4h、5h、6h。應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察饑餓誘導(dǎo)組小鼠成骨細(xì)胞自噬與凋亡的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用Western blot免疫印跡法和Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠成骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3，凋亡相關(guān)蛋白caspase3表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：①透射電鏡結(jié)果顯示單純饑餓誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞在2h前以自噬為主，2h后以凋亡為主，并隨著時(shí)

9、間的延長(zhǎng)，凋亡水平逐漸增高；②Western blot結(jié)果顯示與饑餓誘導(dǎo)組相比，3-MA預(yù)處理饑餓誘導(dǎo)組的LC3轉(zhuǎn)化水平在1h、2h、3h、4h、5h、6h都出產(chǎn)生了明顯的下降趨勢(shì)（P<0.05），caspase3蛋白表達(dá)水平在1h、2h、3h和4h增高（P<0.05)，但0h、5h和6h無(wú)差異（P>0.05）；③Annexin V-FITC/PI檢測(cè)結(jié)果證明和單純饑餓誘導(dǎo)組相比，3-MA預(yù)處理組僅在1h、2h、3h和4h促進(jìn)了細(xì)胞凋亡

10、（P<0.05），而并未影響到0h、5h和6h的細(xì)胞凋亡（P＞0.05）。
　　結(jié)論：在饑餓誘導(dǎo)環(huán)境成骨細(xì)胞早期發(fā)生的自噬作用，可能是細(xì)胞避免死亡的一種保護(hù)機(jī)制，延遲凋亡作用出現(xiàn)的時(shí)間。
　　本研究中體內(nèi)、體外兩方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明，當(dāng)正畸力作用于牙齒后，其壓力側(cè)牙槽骨組織早期出現(xiàn)的自噬作用加強(qiáng)現(xiàn)象可能是骨組織細(xì)胞對(duì)抗氧氣、營(yíng)養(yǎng)不足的一種保護(hù)機(jī)制，可以拮抗、延緩凋亡作用的出現(xiàn)。一旦這種機(jī)體保護(hù)機(jī)制減弱、消失，骨組織細(xì)胞就會(huì)