懸浮培養(yǎng)293細(xì)胞生產(chǎn)腺病毒的工藝及BB102抗癌劑治療小鼠Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:在最近的十幾年中，腺病毒已經(jīng)成為了基因治療的有效載體。到目前為止，世界各國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)的基因治療臨床方案達(dá)到1000多個(gè)，腺病毒載體約占26％。由于越來(lái)越多的腺病毒基因藥物進(jìn)入臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)，急需建立一種有效的可以放大的腺病毒生產(chǎn)工藝，生成出足量的符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)的腺病毒基因藥物產(chǎn)品。持續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)293細(xì)胞是目前生產(chǎn)腺病毒最常用的方法之一，這種方法特別適合于工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)灌注培養(yǎng)293細(xì)胞生產(chǎn)攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的腺病

2、毒載體進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，灌注率為1.5-2vol/d比較適宜；感染Ad-GFP后48小時(shí)是收獲細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)，此時(shí)的單細(xì)胞病毒含量在18200±1700VP/cell左右；細(xì)胞密度在3.0×106/ml左右感染病毒時(shí)單細(xì)胞病毒和單位體積病毒產(chǎn)量均較高。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)我們初步建立起了利用5L生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)293N3S細(xì)胞生產(chǎn)Ad-GFP的生產(chǎn)工藝，可以獲得較大量高滴度的Ad-GFP。 第二部分:重組腺病毒純化的傳統(tǒng)方法是

3、氯化銫密度梯度超速離心，此方法產(chǎn)量小，更重要的是這種方法不能有效放大，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)應(yīng)用陰離子交換樹(shù)脂已經(jīng)逐漸成為了主要分離純化手段并取得了比較好的結(jié)果。我們應(yīng)用兩步陰離子色譜法進(jìn)行了重組腺病毒Ad-GFP的分離與純化，首先用QSepharoseXL對(duì)含有腺病毒的細(xì)胞裂解液進(jìn)行第一次分離純化，然后將含有Ad-GFP的流出液用Source15Q進(jìn)行第二次分離純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)QSepharoseXL第一次分離純化可以有效地去

4、除細(xì)胞裂解液中的部分雜蛋白，但不能獲得較純重組腺病毒Ad-GFP，再次經(jīng)Source15Q純化后可以獲得理想的重組腺病毒，最終的腺病毒回收率在50％左右，產(chǎn)品經(jīng)高壓液相及丙烯酰胺凝膠電泳分析得到了證實(shí)，與氯化銫密度梯度離心法獲得的腺病毒相似。此方法省時(shí)省力，可以進(jìn)行靈活放大，適合于規(guī)?；a(chǎn)。 第三部分:P53基因的突變幾乎見(jiàn)于所有的人類腫瘤中，是腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制之一。在肺癌中p53基因突變高達(dá)75％以上，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切

5、相關(guān)。突變的p53基因不僅促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而且影響基因組的穩(wěn)定性從而加速細(xì)胞的惡變。野生型p53是最常見(jiàn)的抑癌基因之一，它通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑癌作用，因此，野生型p53基因已成為目前腫瘤基因治療中的主要目的基因之一。GM-CSF是在抗原提呈細(xì)胞的成熟和功能發(fā)揮中起重要作用的一種細(xì)胞因子，將外源性GM-CSF導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使其在腫瘤部位持續(xù)表達(dá)，形成一個(gè)GM-CSF高濃度的局部微環(huán)境，可促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟并提高其對(duì)腫瘤抗原的提呈和

6、加工處理能力。B7.1是一種免疫共刺激分子，它屬于免疫球蛋白超家族成員，與第二信號(hào)一起激活T細(xì)胞參與機(jī)體的細(xì)胞免疫。在缺乏共刺激信號(hào)的腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入共刺激分子基因使之有效表達(dá)，可誘導(dǎo)體內(nèi)的T細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。BB-102抗癌劑系我實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶人野生型p53基因和腫瘤免疫相關(guān)基因GM-CSF、B7-1的重組腺病毒，我們應(yīng)用BB-102抗癌劑對(duì)C57小鼠的Lewis肺癌的治療作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中劑量的BB-10