mGITRL基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC增強(qiáng)Lewis肺癌移植瘤小鼠抗瘤免疫的實驗研究.pdf

1、肺癌是目前臨床較為常見的惡性腫瘤，肺癌發(fā)病率約占所有癌癥發(fā)病率的12％。每年全世界有超過130萬人被確診患有肺癌，超過110萬人死于肺癌。盡管目前肺癌的臨床治療已取得一些進(jìn)展，但總體治療效果仍不理想，因此，有必要尋求更為有效的治療手段。圍繞著樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)建立的特異性腫瘤免疫治療方法，為肺癌的生物治療提供了新思路和新方法。
　　 糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)配體(glucocortico

2、id-induced tumor necrosis factor receptor ligand，GITRL)是最近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，可參與對效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的調(diào)控。在本研究中，我們制備攜帶小鼠GITRL(mGITRL)基因的重組腺病毒(pAd-GITRL)，將pAd-GITRL轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)，并研究其生物學(xué)功能變化。在建

3、立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的基礎(chǔ)上，探討pAd-GITRL能否通過上調(diào)DC的免疫刺激功能，調(diào)控效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，從而增強(qiáng)荷瘤小鼠機(jī)體特異性抗瘤免疫應(yīng)答。
　　 第一部分：攜帶小鼠GITRL基因重組腺病毒的制備與鑒定
　　 目的：構(gòu)建能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)mGITRL基因的重組腺病毒，進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增和滴度測定，以用于mGITRL基因治療的實驗研究。
　　 方法：應(yīng)用AdEasy-1腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建

4、攜帶mGITRL基因的重組腺病毒(pAd-GITRL)和對照腺病毒(pAd-null)。首先將目的基因克隆至pAdTrack-CMV形成穿梭載體，然后與腺病毒病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至大腸埃希菌BJ5183中，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，產(chǎn)生包含目的基因的重組腺病毒載體，由于pAdTrack-CMV攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因，因此該病毒載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后，可通過熒光顯微鏡觀察eGFP的表達(dá)來判斷病毒轉(zhuǎn)染效率，通過qRT-PCR和Wes

5、tern blot鑒定目的基因在293A細(xì)胞中的表達(dá)，病毒滴度采用TCID50法測定。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定證實，重組腺病毒載體插入片段為mGITRL基因。包裝的重組腺病毒載體具有良好的感染性，細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，可以在293A細(xì)胞中形成病毒顆粒。通過TCID50法測定pAd-GITRL病毒滴度為2.0×109,pfu/ml;pAd-null病毒滴度為2.5×

6、109 pfu/ml。pAd-GITRL感染293A細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡觀察可見eGFP的表達(dá)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pAd-GITRL的293A細(xì)胞表達(dá)GITRL的mRNA，pAd-null轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞不表達(dá)GITRL的mRNA(mRNA的相對表達(dá)量用2△ct值×103表示)（2△ct值×103:261.90±1.35 vs0.36±0.039 vs0）。Western blot結(jié)果亦顯示，

7、轉(zhuǎn)染了pAd-GITRL的293A細(xì)胞表達(dá)GITRL蛋白，pAd-null轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞不表達(dá)GITRL蛋白。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型攜帶mGITRL基因的pAd-GITRL，pAd-GITRL能有效介導(dǎo)mGITRL在293A細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　 第二部分：pAd-GITRL轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的實驗研究
　　 目的：采用pAd-GITRL轉(zhuǎn)染BMDC，觀察轉(zhuǎn)染

8、前后BMDC表面MHC II類分子和共刺激分子的表達(dá)情況。同時體外研究pAd-GITRL轉(zhuǎn)染的BMDC(pAd-GITRL-BMDC)對CD4+ CD25-T細(xì)胞增殖和CD4+CD25+ Treg細(xì)胞免疫抑制功能的影響。
　　 方法：小鼠骨髓前體細(xì)胞經(jīng)終濃度均為10ng/ml的GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，并通過顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行形態(tài)和純度鑒定。7d后分別用pAd-GITRL和pAd-null轉(zhuǎn)染BMDC

9、，通過免疫熒光染色和FCM檢測pAd-GITRL轉(zhuǎn)染前后BMDC表面MHC II類分子、CD40、CD80和CD86的表達(dá)情況。通過體外細(xì)胞增殖試驗檢測pAd-GITRL-BMDC對抗CD3mAb刺激的CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖，以及對CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制功能的影響。
　　 結(jié)果：小鼠骨髓前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，在倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞體積增大，且呈不規(guī)則突起，形似樹突狀；FCM檢測CD11c+比例達(dá)

10、79.07％。通過熒光顯微鏡觀察eGFP的表達(dá)可知pAd-GITRL能有效轉(zhuǎn)染BMDC。FCM結(jié)果顯示BMDC轉(zhuǎn)染pAd-GITRL后，體外培養(yǎng)8d仍能穩(wěn)定表達(dá)GITRL。相對于BMDC組，pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC表面CD40、CD80和CD86均有所升高，但組間無顯著性差異，MHC II類分子無明顯變化?？笴D3 mAb刺激的CD4+ CD25-T細(xì)胞增殖試驗中，pAd-GITRL-BMDC組的cpm值

11、為6888±1304，與BMDC（848±59）和pAd-null-BMDC（1231±75）相比有顯著性差異(p<0.05)。CD4+ CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制功能試驗結(jié)果顯示，pAd-GITRL-BMDC共培養(yǎng)體系中Treg細(xì)胞的抑制率為44.7±17.2％，與BMDC（63.7±17.4％）和pAd-null-BMDC（90.3±11.9％）相比明顯下降(p<0.05)。
　　 結(jié)論：體外成功誘導(dǎo)和培養(yǎng)BMDC，pA

12、d-GITRL在體外能有效轉(zhuǎn)染BMDC，并且持續(xù)性表達(dá)GITRL。pAd-GITRL-BMDC能顯著增強(qiáng)CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖，同時能部分下調(diào)CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能，第三部分：pAd-GITRL-BMDC增強(qiáng)Lewis肺癌移植瘤小鼠抗瘤免疫應(yīng)答的實驗研究
　　 目的：探討pAd-GITRL-BMDC能否增強(qiáng)Lewis肺癌移植瘤小鼠體內(nèi)抗瘤免疫應(yīng)答，尋求mGITRL在調(diào)控免疫應(yīng)答中的作用及其抗瘤免疫的機(jī)制。

13、
　　 方法：通過皮下接種小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型。隨機(jī)分為BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC和PBS四組。按照3:1的比例，將3.0×106 Lewis細(xì)胞的裂解液分別加入BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC（1.0×106/孔）培養(yǎng)體系中，37℃、5％ C02孵育24h。皮下接種Lewis后第10d、第12d和第14d，每組小鼠分別

14、瘤內(nèi)多點注射1×106/100μl腫瘤抗原負(fù)載的BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC，PBS組僅注射100μl PBS，觀察荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況。部分小鼠在最后一次注射6d后，斷頸處死荷瘤小鼠，F(xiàn)CM檢測荷瘤小鼠脾臟中CD8+IFN-γ+T細(xì)胞、CD4+CD25+ Foxp3+T細(xì)胞和CD4+IL-17+T細(xì)胞的數(shù)量與比例，qRT-PCR檢測腫瘤組織中GITRL、IFN-γ、Foxp3、IL-17、R

15、OR-γt和CCL20的表達(dá)情況，免疫熒光染色法檢測腫瘤組織中CD8+IFN-γ+T細(xì)胞、CD4+ Foxp3+T細(xì)胞和CD4+IL-17+T細(xì)胞的分布情況。
　　 結(jié)果：pAd-GITRL-BMDC組抑制腫瘤生長的作用較pAd-null-BMDC組、BMDC組和PBS組明顯，皮下種植Lewis后第30d，各組腫瘤的大小分別為210.5±20.5，327.7±39.1，419.0±91.9和646.6±98.7mm2.在70 d

16、的觀察期內(nèi)，pAd-GITRL-BMDC組的生存率為75％，pAd-null-BMDC組生存率為29％，BMDC組和PBS組生存率為0％。FCM分析小鼠脾臟中CD8+ IFN-γ+T細(xì)胞的比例，pAd-GITRL-BMDC組為32.29±14.5％，明顯高于pAd-null-BMDC組（24.32±6.83％，p<0.05）。CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例在各組間沒有明顯差異，但pAd-GITRL-BMDC組小鼠

17、脾臟中Treg細(xì)胞的數(shù)量與pAd-null-BMDC組相比卻顯著降低(9.48×105±2.21×105 vs2.07×106±1.21×106,p<0.05) BMDC、pAd-null-BMDC、pAd-GITRL-BMDC三組小鼠脾臟中CD4+ IL-17+T細(xì)胞比例均明顯高于PBS組，但各治療組間并無顯著性差異。腫瘤組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，pAd-GITRL-BMDC組與其他各組相比，腫瘤組織中CD8+IFN-γ+T細(xì)胞和CD

18、4+IL-17+T細(xì)胞明顯增多，而CD4+Foxp3+T細(xì)胞明顯減少。qRT-PCR檢測顯示（各個指標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量用2△ct值×103表示），pAd-GITRL-BMDC組與pAd-null-BMDC組的GITRL分別為55.30±26.50和16.27±5.12，IFN-γ分別為17.42±4.87和9.37±2.72，IL-17分別為13.10±4.20和8.12±0.45，ROR-γt分別為273.44±51.20和72.

19、42±5.21，CCL20分別為273.44±51.20和72.42±5.21，表明pAd-GITRL-BMDC組與pAd-null-BMDC組月中瘤組織中GITRL、IFN-γ,IL-17、ROR-γt和CCL20的表達(dá)均有顯著性增高(p<0.05)；但pAd-GITRL-BMDC組與pAd-null-BMDC組腫瘤組織中的Foxp3分別為3.09±0.93和12.78±5.60(p<0.05)。
　　 結(jié)論：pAd-GITR