干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：研究干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化不僅可以應(yīng)用于臨床，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森癥、腦卒中、脊髓病變患者進(jìn)行細(xì)胞移植，使其盡快康復(fù)；還可以作為研究哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的體外模型，了解神經(jīng)分化過程中基因表達(dá)調(diào)控的變化，并方便進(jìn)行基因操作。 既往認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，其損傷后很難再由神經(jīng)干細(xì)胞補(bǔ)充。因此，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷不能再生，尤其哺乳類動(dòng)物神經(jīng)元缺乏再生能力。 從上世紀(jì)80年代開始，有研究表明移植外周神經(jīng)和胎髓能促

2、進(jìn)脊髓損傷軸突的再生。以后，諸多實(shí)驗(yàn)顯示了脊髓損傷后可能會(huì)再生。最近，有研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷可由神經(jīng)干細(xì)胞來補(bǔ)充。而且，其它來源的干細(xì)胞，如：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)和胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ESCs)在一定條件下均可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。但是，誘導(dǎo)分化的比例還很低。 將大鼠MSCs移植到脊髓挫裂傷的大鼠體內(nèi)，顯示了明顯的功能恢復(fù)。研究者直接地或?qū)⒋?/p>

3、鼠MSCs與神經(jīng)球細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過局部注射的方式移植進(jìn)大鼠損傷脊髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能比對(duì)照組明顯恢復(fù)，形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示移植的MSCs位于損傷區(qū)中心，且朝向損傷中心牽拉宿主組織，阻止脊髓空洞的形成。雖然諸多研究表明MSCs可部分修復(fù)損傷脊髓的解剖連接，但目前仍無充分證據(jù)證明MSCs能夠恢復(fù)損傷脊髓的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。 本實(shí)驗(yàn)擬摸索出一種簡(jiǎn)便有效、無毒性的體外大比例誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，并通過移植干細(xì)胞研究其體內(nèi)

4、向神經(jīng)細(xì)胞分化。并進(jìn)一步通過基因芯片分析證實(shí)誘導(dǎo)結(jié)果，篩選向神經(jīng)細(xì)胞分化的主導(dǎo)基因，研究干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)理。 方法： 1.MSCs的分離培養(yǎng)、鑒定和向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化 1.1在無菌條件下取Wistar大鼠股骨和脛骨骨髓細(xì)胞做原代培養(yǎng)。 1.2根據(jù)細(xì)胞貼壁性能不同，篩選易貼壁但貼壁不牢的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定MSCsCD45和CD90的表達(dá)情況。 1.4

5、向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化：β-巰基乙醇+DMSO+降低血清濃度 1.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)NSE。 2.ESCs培養(yǎng)、鑒定和向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化 2.1鈣鈷法堿性磷酸酶染色鑒定未分化ESCs。 2.2免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原Nestin、NSE、NCAM1、NF-L和GFAP。 2.3ESCs(鼠ES細(xì)胞系A(chǔ)B2.1由南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng))按常規(guī)培養(yǎng)于飼養(yǎng)層細(xì)胞上。誘導(dǎo)分化時(shí)去飼養(yǎng)層細(xì)胞，重新接

6、種于無包被的培養(yǎng)皿中，使用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，逐漸更換為無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液。 3.MSCs體內(nèi)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞 3.1BrdU(5’-溴脫氧尿苷)體外標(biāo)記MSCs。 3.2MSCs移植。 3.2.1制備大鼠脊髓左側(cè)半橫斷損傷模型。 3.2.2實(shí)驗(yàn)組12只：術(shù)后立即向損傷區(qū)遠(yuǎn)端注射MSCs，對(duì)照組12只：注射等量磷酸緩沖鹽溶液。 3.3移植后鑒定。 3.3.1采用BBB評(píng)分系統(tǒng)評(píng)

7、估大鼠行為學(xué)改變。 3.3.2心臟灌流固定大鼠脊髓組織。 3.3.3免疫組織化學(xué)染色法觀察BrdU標(biāo)記的MSCs在脊髓損傷處存活情況。 3.3.4取材前48小時(shí)行辣根過氧化物酶(HRP)逆行示蹤。 3.3.5HRP示蹤結(jié)果觀察脊髓損傷處神經(jīng)通路的重構(gòu)建。 3.3.6皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)測(cè)定脊髓損傷處神經(jīng)通路傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。 4.表達(dá)基因芯片分析采用AffymetrixMOE430A

8、小鼠表達(dá)譜芯片進(jìn)行未分化及分化后第4、10天細(xì)胞基因表達(dá)譜差異的分析。 5.半定量RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)ESCs、神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因。 6.誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)(TRAP)。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 一、MSCs分離培養(yǎng)和向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化1.MSCs免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CD45完全陰性，CD9070％陽(yáng)性。2.MSCs在預(yù)誘導(dǎo)和更換為無血清培養(yǎng)液后產(chǎn)生似神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞

9、80％表達(dá)NSE。 二、MSCs體內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化 1.術(shù)后實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能比對(duì)照組恢復(fù)明顯，1周、2周、3周、4周，8周BBB評(píng)分均高于對(duì)照組。 2.術(shù)后1周行石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色顯示在實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓損傷區(qū)遠(yuǎn)端檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。 3.術(shù)后2個(gè)月行冰凍切片，在實(shí)驗(yàn)組大鼠的損傷脊髓近側(cè)端的腹側(cè)角檢測(cè)到HRP陽(yáng)性細(xì)胞，而于對(duì)照組大鼠未檢測(cè)到HRP陽(yáng)性細(xì)胞。 4.術(shù)后2個(gè)月行CSE

10、P測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組大鼠的CSEP波形恢復(fù)但波幅減低，潛時(shí)期延長(zhǎng)，對(duì)照組大鼠未見CSEP引出。 三、ESCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞未分化的ESCs聚集成團(tuán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞排列緊密，集落邊界清楚，堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，胞漿布滿棕黑色顆粒。使用序貫誘導(dǎo)法可將ESCs大比例誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)均一、胞體圓亮、突起細(xì)長(zhǎng)。分化細(xì)胞表達(dá)多種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，免疫熒光法示NSE、NCAM1陽(yáng)性率＞80％，GFAP＜1％。 四

11、、ESCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞機(jī)理研究 基因芯片檢測(cè)誘導(dǎo)后第10天細(xì)胞Nestin、Sox2、Cdk5、Dnmt3A、NSE、NF-M、NCAM1、MAP2等神經(jīng)特異性基因均有高表達(dá)，且有GABA受體、谷氨酸脫羧酶(GAD)表達(dá)，其他神經(jīng)遞質(zhì)受體及其合成酶等未見表達(dá)，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞大多為GABA能神經(jīng)元。膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因GFAP、MBP未檢測(cè)到，其他胚層的標(biāo)志性基因也沒有表達(dá)。半定量RT-PCB亦證實(shí)上述結(jié)果。 未分化

12、ESCs端粒酶活性最強(qiáng)，隨分化天數(shù)增加，端粒酶活性逐漸下降，至第10天，端粒酶活性已經(jīng)很弱，但仍強(qiáng)于PMEF-P3。 結(jié)論： 1.應(yīng)用beta-巰基乙醇和無血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞可達(dá)到80％的分化率。 2.局部注射MSCs移植進(jìn)脊髓損傷區(qū)，MSCs可在損傷區(qū)存活并分化為神經(jīng)元，在損傷局部形成神經(jīng)元通路，使損傷脊髓的遠(yuǎn)端和近端建立聯(lián)系，從而使脊髓神經(jīng)纖維傳導(dǎo)功能恢復(fù)。 3.通過我們實(shí)驗(yàn)摸索出的