HIV-1整合酶活性檢測方法建立和應用研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的獲得性免疫缺陷綜合癥（艾滋病）是人類歷史上最嚴重、最致命的疾病之一。艾滋病目前仍然不能治愈。HIV編碼的整合酶(IN)介導病毒DNA與宿主細胞基因組整合，是病毒復制所必需的關鍵酶之一。抑制IN的功能能夠有效阻斷病毒在宿主細胞內的復制。同時，由于正常人體細胞中沒有IN的功能類似物，特異性作用于IN的抑制劑對人體的副作用可能很小。因此，IN被認為是抗HIV藥物研發(fā)的理想靶點。
　　 IN在體內主要通過

2、催化3＇加工和鏈轉移兩步反應實現(xiàn)整合過程。以上兩步反應能夠在體外使用重組IN蛋白、寡核苷酸DNA底物以及二價金屬輔助離子實現(xiàn)。此外，IN還能在體外催化鏈轉移的逆反應——去整合，將鏈轉移形成的DNA產物重新還原生成病毒DNA和靶DNA。建立高效的IN活性檢測方法，并據此開展抑制劑的篩選，是當前IN抑制劑體外篩選的主要手段，也是以IN為靶點的抗病毒藥物研發(fā)的熱點之一。本研究表達純化了重組IN蛋白，建立了IN活性檢測的一系列高通量方法，并應用

3、這些方法進行了IN的性質、抑制劑篩選等方面的研究。論文內容主要包括以下幾個方面：
　　 (1)整合酶蛋白表達純化及3＇加工活性高通量檢測方法的建立
　　 使用PCR獲取了HXB2CG病毒株IN基因，通過序列分析，設計突變引物，使用重疊PCR方法將HXB2CG IN基因突變?yōu)镠IV NL4-3 IN基因，并引入了F185K/C280S突變以提高蛋白溶解性。將目的基因連接到pET表達載體中，在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了高效且可

4、溶性表達。通過親和層析方法，從細胞破碎上清液中純化到純度高且具有3＇加工和鏈轉移功能活性的重組IN蛋白。
　　 根據分子信標的原理，設計了熒光基團和淬滅基團標記的模擬病毒DNA序列的3＇加工DNA底物，提出了一種檢測3＇加工反應活性的新型熒光分析法。實驗表明，該方法不但靈敏度、特異性高，操作簡單，方便快捷，為全液相反應環(huán)境，而且能夠實時定量監(jiān)測IN3＇加工反應。該方法能夠用于IN3＇加工反應性質研究和以3＇加工為靶標的IN抑制劑

5、高通量篩選。本研究建立的3＇加工反應熒光檢測方法有潛力應用到其他蛋白質與DNA相互作用的研究中，具有重要的學術和應用價值。
　　 (2)整合酶鏈轉移活性高通量檢測方法的建立和應用
　　 抑制鏈轉移反應被認為是體內抑制IN功能活性的關鍵，當前IN抑制劑的體外篩選主要以鏈轉移反應為靶標。本研究設計合成了分別用生物素和地高辛修飾的供體DNA和靶DNA，引入了鏈霉親和素磁珠捕獲反應DNA產物，提出了檢測IN鏈轉移反應活性或者檢測

6、3＇加工與鏈轉移反應整體活性的高通量酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。
　　 與之前的各種方法相比，我們提出的高通量ELISA具有明顯的改進：(ⅰ)無需使用放射性底物，實現(xiàn)了高通量；(ⅱ)反應時所有的試劑均自由懸浮在液體環(huán)境中，磁珠-DNA產物、磁珠-抗體接觸更容易更充分，顯著提高靈敏度，還能靈活應用到研究反應中各試劑的相互作用，有助于研究抑制劑的作用機理；(ⅲ)無需包被、封閉微孔板，省時省力，檢測前轉移磁珠至新的微孔板能夠幾乎

7、完全消除微孔板對試劑的非特異性吸附，有效降低了背景值，提高了特異性；(ⅳ)ELISA和熒光免疫吸附測定(FLISA)兩種檢測策略并用，增加了方法的應用范圍。
　　 成功應用高通量ELISA研究了金屬離子對鏈轉移反應的影響，得出了一些有意義的結果。使用已知IN抑制劑證明了高通量ELISA應用到IN抑制劑篩選中的有效性，且從天然產物提取物和合成化合物中成功篩選了數(shù)個具有初步活性的IN抑制劑。
　　 (3)整合酶去整合活性高通

8、量檢測方法的建立
　　 IN在體外能通過去整合反應實現(xiàn)對整合過程的逆轉，且整合酶核心區(qū)(IN-CCD)具有獨立催化去整合功能。建立去整合活性高通量檢測方法對研究IN功能及篩選IN抑制劑都具有重要意義。本研究表達純化了具有功能活性的野生型IN及IN-CCD蛋白，設計合成了生物素和地高辛雙標記的去整合DNA底物，基于鏈霉親和素磁珠捕獲生物素標記DNA，建立了一種檢測IN和IN-CCD體外去整合活性的高通量ELISA。
　　

9、研究了金屬離子對去整合高通量ELISA的影響，結果表明與3＇加工和鏈轉移反應相似，IN去整合反應也更偏好于使用Mn2+而不是Mg2+為金屬輔助離子。進一步使用NaCl滴定實驗分析表明，IN去整合對Mn2+的選擇偏好性與Mn2+比Mg2+更能穩(wěn)定IN-DNA復合物有關。使用了已知IN抑制劑baicalein驗證去整合高通量ELISA篩選IN抑制劑的有效性，證明了baicalein是明確的以IN-CCD為靶標的IN抑制劑。本研究建立的去整合

10、高通量ELISA具有高通量、高靈敏度、高特異性、低背景、省時省力等優(yōu)點，能夠應用到去整合反應、抑制劑作用機理等研究中，且具有應用到以IN為靶標，特別是以IN-CCD為靶標的抑制劑高通量篩選的潛力。
　　 野生型(wT)IN和IN-CCD溶解性較差，在大腸桿菌中表達時容易形成包涵體，給后期純化及蛋白質功能研究帶來不便，而F185K突變后IN和IN-CCD能實現(xiàn)可溶性表達且活性不受影響。通過構建、表達、純化得到WT和F185K突變型

11、IN-CCD，比較了其溶解性和活性差別。分析并比較了WT和F185K/C280S突變型IN蛋白溶解性和活性差別。結果表明，F(xiàn)185K和F185K/C280S突變后IN和IN-CCD的溶解性顯著提高，能夠實現(xiàn)可溶性表達；同時，突變后IN-CCD的去整合活性有一定程度的降低，IN的3＇加工和鏈轉移活性有一定程度降低。
　　 進一步通過同源模建，構建了WT和F185K突變型IN-CCD的蛋白結構，并在水溶液中進行了1800ps的分子動

12、力學(MD)模擬，得出了一些有意義的結果：(ⅰ)F185K突變后，體系的功能loop區(qū)柔性有一定程度的降低，整體運動性略有減小，催化核心DDE基序殘基之間距離無顯著變化，因此，突變后蛋白催化活性降低，但活性受影響程度不大；(ⅱ)F185K突變對IN-CCD內部靜電相互作用網絡的改變驅動了蛋白構象的變化，特別是loop區(qū)構象變化明顯，引起蛋白表面的部分疏水殘基被包埋，親水殘基暴露，造成IN-CCD相對的極性溶劑可接近面積增大。同時，F(xiàn)18