新型HIV-1非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和活性研究.pdf

1、艾滋病(AIDS)是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類生命健康的傳染性疾病，其病原體為人類免疫缺陷病毒(HIV)，其中RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-1是致病主要的病毒亞型。而HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase，RT)在該病毒的復(fù)制周期中具有關(guān)鍵性的作用，使其成為抗HIV-1藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。作用于RT的抑制劑主要分為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NucleosideReverseTranscriptaseInhibitors，NRTIs

2、)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)。其中，NNRTIs由于其活性高、選擇性強(qiáng)、毒性低等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前治療艾滋病高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)重要組成部分。但是NNRTIs在臨床治療出現(xiàn)的耐藥性、毒副作用以及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)差的問題在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，研發(fā)新型高效低毒、廣譜抗耐藥以及具有良好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的新型NNRTI是目前抗艾滋病藥物研究的重要方向之一。
　　本論文第一部分研究將選取對(duì)HIV-1病毒具

3、有高效抗耐藥性NNRTIs—二芳基嘧啶類(Diarylpyridine，DAPY)上市藥物TMC125(Etrivirine)和3-碘基-4-苯氧基吡啶酮類(3-iodo-4-phenoxy-2-pyridinones，IOPY)衍生物R221239為先導(dǎo)，基于兩者結(jié)合模式和藥效基團(tuán)的類似性，根據(jù)它們與RT結(jié)合的晶體復(fù)合物分子疊合結(jié)果，運(yùn)用分子雜合的藥物設(shè)計(jì)策略，將兩類抑制劑的優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行合理組合，設(shè)計(jì)了一類新型DAPY-IOPY雜

4、合體NNRTIs:(1)以IOPY類衍生物的2-吡啶酮為母核，以保持其與K101和K103氨基酸殘基骨架的氫鍵作用，同時(shí)在2-吡啶酮3位上引入鹵素，以與V179和Y188形成靜電作用;(2)將DAPY類化合物右翼的苯胺基團(tuán)遷移到吡啶酮6位，并在芳環(huán)對(duì)位引入不同的取代基，考察其對(duì)活性的影響;(3)將DAPY類化合物的優(yōu)勢(shì)取代基—2，4，6-三取代苯氧基和IOPY類化合物的優(yōu)勢(shì)取代基—3，5-二甲基苯氧基分別遷移2-吡啶酮的4位。由此設(shè)計(jì)了

5、一系列3-鹵代-4-苯氧基-6-苯胺基-1H-2-吡啶酮衍生物(SeriesⅠA)。同時(shí)，對(duì)SeriesⅠA化合物右翼芳環(huán)與中心雜環(huán)之間的NH連接基團(tuán)以CH2取代，設(shè)計(jì)了第二系列DAPY-IOPY雜合體衍生物—3-碘-4-苯氧基-6-芐基-1H-2-吡啶酮衍生物(SeriesⅠB)。
　　經(jīng)過定向合成我們得到了兩個(gè)系列31個(gè)目標(biāo)化合物，活性結(jié)果顯示，大部分SeriesⅠA化合物對(duì)野生型HIV-1(ⅢB)毒株表現(xiàn)出亞微摩爾到微摩爾水

6、平的活性，其中活性最好的化合物ⅠA-7d對(duì)野生型HIV-1ⅢB毒株的EC50值為0.15μM，優(yōu)于DLV(EC50=0.91μM)、ddC(EC50=1.39μM)和NVP(EC50=0.113μM)。DAPY-IOPY雜合衍生物SeriesⅠA的構(gòu)效關(guān)系研究顯示:(1)2-吡啶酮母環(huán)對(duì)保持活性非常重要，以2-氯吡啶或2-甲氧基吡啶取代吡啶酮環(huán)活性降低，在吡啶酮3位上引入鹵素活性下降，3位取代基對(duì)活性的貢獻(xiàn)順序?yàn)镠＞I＞Br/Cl;(2

7、)兩翼取代基的SAR特征同DAPY類化合物一致，與IOPY類化合物不同:右翼芳環(huán)上活性最高的取代基為CN，左翼芳環(huán)的最優(yōu)取代基為TMC125的活性取代基—4-氰基-2，6-二甲基，但被R221239的優(yōu)勢(shì)取代基—3，5-二甲基取代時(shí)化合物活性完全喪失。與SeriesⅠA不同，SeriesⅠB化合物表現(xiàn)出與IOPY類衍生物類似的構(gòu)效關(guān)系。尤其左翼芳環(huán)為3，5-二甲基取代的化合物ⅠB-7a(EC50=0.22μM)，不僅其抗HIV-1ⅢB活

8、性高于2，4，6-三甲基取代的化合物ⅠB-7b(EC50=0.32μM)，而且對(duì)RES056(K103N+Y181C)雙突變嚴(yán)重耐藥毒株也具有較好的活性(EC50=1.71μM)。我們對(duì)DAPY-IOPY雜合體衍生物SeriesⅠA和SeriesⅠB代表性化合物進(jìn)行了分子對(duì)接研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SeriesⅠANNRTIs衍生物與RT的結(jié)合模式更加類似于TMC125，而SeriesⅠB雜合體NNRTIs與RT的結(jié)合模式基本與R221239相一

9、致，與構(gòu)效關(guān)系研究的結(jié)論相互印證。
　　我們對(duì)DAPY-IOPY雜合體NNRTIs體外抗HIV-1ⅢB活性最好的4個(gè)化合物，進(jìn)行了進(jìn)一步的活性研究。在臍帶血單個(gè)核細(xì)胞系(cordbloodmononuclearcells，CBMC)的抗HIV-1活性測(cè)試表明，ⅠA-7d、ⅠA-7c、ⅠB-7a和ⅠB-7b對(duì)病人體內(nèi)分離的原始R5毒株和R4毒株的活性處于亞微摩爾級(jí);ELISA雙抗夾心法抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)試顯示，化合物ⅠA-7

10、d和ⅠA-7c對(duì)RT的抑制活性分別為5.2μM和39μM;定量PCR分析MT-4細(xì)胞單輪感染HIV-1NL4-3毒株后細(xì)胞內(nèi)病毒總DNA含量表明，化合物ⅠA-7d、ⅠA-7c、ⅠB-7a或ⅠB-7b濃度為10μM時(shí)，對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄晚期DNA產(chǎn)物的抑制率達(dá)99.2％，88.6％，98.3％和97.5％，驗(yàn)證了本研究所設(shè)計(jì)DAPY-IOPY雜合化合物的通過抑制RT逆轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮抗HIV-1活性。
　　本論文第二部分研究根據(jù)DAPY類化

11、合物與NNIBP晶體結(jié)構(gòu)的解析和分子對(duì)接模擬研究，在對(duì)NNIBP中可容納區(qū)域Ⅰ和可容納區(qū)域Ⅱ兩個(gè)結(jié)構(gòu)修飾有利位點(diǎn)的契合適配性分析基礎(chǔ)上，通過在吡啶類DAPY衍生物的右翼芳環(huán)和中心吡啶環(huán)之間插入哌啶胺極性基團(tuán)，并在右翼末端芳環(huán)上引入-SONH2等極性基團(tuán)，以開發(fā)與NNIBP中可容納區(qū)域Ⅰ周圍氨基酸殘基的氫鍵作用力，并改善藥物溶解度，設(shè)計(jì)了一系列具有哌啶胺柔性側(cè)鏈的吡啶類DAPY衍生物(SeriesⅡA)。同時(shí)，本研究在嘧啶和吡啶類DAPY

12、衍生物的中心雜環(huán)和右翼芳環(huán)上位于NNIBP可容納區(qū)域Ⅰ和可容納區(qū)域Ⅰ的位置，引入水溶性較高的嗎啉或哌嗪基團(tuán)，設(shè)計(jì)了第二系列嗎啉和哌嗪基團(tuán)修飾的吡啶和嘧啶類DAPY衍生物(SeriesⅡB)，并分別用分子對(duì)接研究驗(yàn)證了SeriesⅡA和SeriesⅡB化合物設(shè)計(jì)的合理性。
　　對(duì)定向合成得到的兩個(gè)系列29個(gè)化合物的體外抗HIV-1病毒活性測(cè)試結(jié)構(gòu)表明，化合物ⅡA-8c2，ⅡA-8c3，ⅡA-8c4和ⅡA-8b3抑制HIV-1NL4-

13、3毒株的EC50值分別為0.1nM、0.05nM、0.8nM和0.3nM(SI=20349-242800);對(duì)HIV-1ⅢB野生毒株的活性分別為9.1nM、7.4nM、9.3nM和7.8nM(SI=168-1283)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于上市藥物NVP、3TC與DLV(EC50=0.29μM，3.1μM，0.61μM)，并與上市藥物ETV、AZT和EFV的活性(EC50=7.0nM，6.8nM，9.5nM)相當(dāng)。此外，化合物ⅡA-8b2、ⅡA-8b

14、3對(duì)具有嚴(yán)重耐藥性的RES056(K103N+Y181C)毒株也表現(xiàn)出一定的活性(EC50=6.2μM，6.8μM)。SeriesⅡA衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究表明，左翼苯環(huán)上取代基R1對(duì)活性的貢獻(xiàn)順序?yàn)?-CN-2，6-二甲基＞2，4，6-三甲基;毗啶環(huán)6位取代基R3對(duì)活性的貢獻(xiàn)順序?yàn)镃l＞OCH3;右翼哌啶胺基團(tuán)N1位取代基R2對(duì)活性的貢獻(xiàn)順序?yàn)?-SO2NH2-苯基＞4-SO2Me-苯基＞吡啶-4-基＞4-CONH2-苯基＞苯基＞環(huán)丙基

15、或環(huán)丁基。SeriesⅡB化合物的抗病毒活性結(jié)果表明，在NNIBP的可容納區(qū)域Ⅰ和Ⅱ引入水溶性較好的嗎啉或者哌嗪基團(tuán)，基本上可以保持先導(dǎo)化合物原有的活性。該系列活性最好的化合物ⅡB-8b抑制HIV-1NL4-3毒株的EC50值為9.1nM(SI=2596)，同時(shí)有望具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
　　本論文第三部分工作是在本課題組前期N2，N4-雙取代-吡咯[1，2-b][1，2，4，6]噻三嗪-1，1，3-三酮衍生物(PTTDs)研

16、究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討該類化合物N2位上多樣性取代基引入對(duì)構(gòu)效關(guān)系的影響(SeiresⅢ)。本研究嘗試對(duì)PTTD類化合物合成采用了新的合成路線，闡明了其可能的反應(yīng)機(jī)制。對(duì)所合成PTTD類目標(biāo)化合物進(jìn)行了體外抗HIV活性試驗(yàn)。結(jié)果表明化合物ⅢB-10a10具有抗野生型HIV-1毒株的活性，其N2位的3，5-二甲基丙烯基為已報(bào)道的多種活性NNRTI分子結(jié)構(gòu)中的普遍存在的優(yōu)勢(shì)基團(tuán)。分子對(duì)接研究顯示，ⅢB-10a10N2位上的3，5-二甲基丙烯

17、基與TIBO化合物的3，5-二甲基丙烯基在NNIBP中的位置基本疊合，都處于Y181和Y188形成疏水亞口袋中。該研究結(jié)果體現(xiàn)了NNRTIs優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)片段的類似性和結(jié)合模式的類似性之間具有內(nèi)在聯(lián)系，為下一步繼續(xù)基于NNRTIs的分子結(jié)構(gòu)多樣性以及結(jié)合模式和優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)基團(tuán)的類似性，進(jìn)行PTTD類衍生物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要思路。
　　綜上所述，本課題設(shè)計(jì)以先導(dǎo)化合物/RT復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效關(guān)系為研究起點(diǎn)，充分考慮先導(dǎo)化合物與結(jié)構(gòu)多

18、樣的NNRTIs藥效團(tuán)上類似性，以優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)片段為導(dǎo)向，變換中心雜環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)、修飾側(cè)鏈取代基及邊鏈，以開發(fā)與RT結(jié)合位點(diǎn)的附加作用力，并提高溶解度;藥物設(shè)計(jì)綜合運(yùn)用生物電子等排體、分子雜合、片段遷移等經(jīng)典藥物設(shè)計(jì)手段，并與計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的應(yīng)用相結(jié)合。最后經(jīng)定向合成了三個(gè)系列75個(gè)化合物，經(jīng)過活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抗HIV-1活性達(dá)到納摩爾甚至皮摩爾水平的抑制劑，并有3個(gè)化合物(ⅠB-7a、ⅡA-8b2、ⅡA-8b3)對(duì)多藥耐藥毒株RES