新型HIV-1非核苷類逆轉錄酶抑制劑的設計、合成和活性研究.pdf

1、艾滋病(AIDS)是當今世界嚴重威脅人類生命健康的傳染性疾病，其病原體為人類免疫缺陷病毒(HIV)，其中RNA逆轉錄病毒HIV-1是致病主要的病毒亞型。而HIV-1逆轉錄酶(reversetranscriptase，RT)在該病毒的復制周期中具有關鍵性的作用，使其成為抗HIV-1藥物研發(fā)的重要靶點。作用于RT的抑制劑主要分為核苷類逆轉錄酶抑制劑(NucleosideReverseTranscriptaseInhibitors，NRTIs

2、)和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)。其中，NNRTIs由于其活性高、選擇性強、毒性低等諸多優(yōu)點，是目前治療艾滋病高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)重要組成部分。但是NNRTIs在臨床治療出現(xiàn)的耐藥性、毒副作用以及藥代動力學性質差的問題在一定程度上限制了其臨床應用。因此，研發(fā)新型高效低毒、廣譜抗耐藥以及具有良好藥代動力學性質的新型NNRTI是目前抗艾滋病藥物研究的重要方向之一。
　　本論文第一部分研究將選取對HIV-1病毒具

3、有高效抗耐藥性NNRTIs—二芳基嘧啶類(Diarylpyridine，DAPY)上市藥物TMC125(Etrivirine)和3-碘基-4-苯氧基吡啶酮類(3-iodo-4-phenoxy-2-pyridinones，IOPY)衍生物R221239為先導，基于兩者結合模式和藥效基團的類似性，根據(jù)它們與RT結合的晶體復合物分子疊合結果，運用分子雜合的藥物設計策略，將兩類抑制劑的優(yōu)勢結構片段進行合理組合，設計了一類新型DAPY-IOPY雜

4、合體NNRTIs:(1)以IOPY類衍生物的2-吡啶酮為母核，以保持其與K101和K103氨基酸殘基骨架的氫鍵作用，同時在2-吡啶酮3位上引入鹵素，以與V179和Y188形成靜電作用;(2)將DAPY類化合物右翼的苯胺基團遷移到吡啶酮6位，并在芳環(huán)對位引入不同的取代基，考察其對活性的影響;(3)將DAPY類化合物的優(yōu)勢取代基—2，4，6-三取代苯氧基和IOPY類化合物的優(yōu)勢取代基—3，5-二甲基苯氧基分別遷移2-吡啶酮的4位。由此設計了

5、一系列3-鹵代-4-苯氧基-6-苯胺基-1H-2-吡啶酮衍生物(SeriesⅠA)。同時，對SeriesⅠA化合物右翼芳環(huán)與中心雜環(huán)之間的NH連接基團以CH2取代，設計了第二系列DAPY-IOPY雜合體衍生物—3-碘-4-苯氧基-6-芐基-1H-2-吡啶酮衍生物(SeriesⅠB)。
　　經(jīng)過定向合成我們得到了兩個系列31個目標化合物，活性結果顯示，大部分SeriesⅠA化合物對野生型HIV-1(ⅢB)毒株表現(xiàn)出亞微摩爾到微摩爾水

6、平的活性，其中活性最好的化合物ⅠA-7d對野生型HIV-1ⅢB毒株的EC50值為0.15μM，優(yōu)于DLV(EC50=0.91μM)、ddC(EC50=1.39μM)和NVP(EC50=0.113μM)。DAPY-IOPY雜合衍生物SeriesⅠA的構效關系研究顯示:(1)2-吡啶酮母環(huán)對保持活性非常重要，以2-氯吡啶或2-甲氧基吡啶取代吡啶酮環(huán)活性降低，在吡啶酮3位上引入鹵素活性下降，3位取代基對活性的貢獻順序為H＞I＞Br/Cl;(2

7、)兩翼取代基的SAR特征同DAPY類化合物一致，與IOPY類化合物不同:右翼芳環(huán)上活性最高的取代基為CN，左翼芳環(huán)的最優(yōu)取代基為TMC125的活性取代基—4-氰基-2，6-二甲基，但被R221239的優(yōu)勢取代基—3，5-二甲基取代時化合物活性完全喪失。與SeriesⅠA不同，SeriesⅠB化合物表現(xiàn)出與IOPY類衍生物類似的構效關系。尤其左翼芳環(huán)為3，5-二甲基取代的化合物ⅠB-7a(EC50=0.22μM)，不僅其抗HIV-1ⅢB活

8、性高于2，4，6-三甲基取代的化合物ⅠB-7b(EC50=0.32μM)，而且對RES056(K103N+Y181C)雙突變嚴重耐藥毒株也具有較好的活性(EC50=1.71μM)。我們對DAPY-IOPY雜合體衍生物SeriesⅠA和SeriesⅠB代表性化合物進行了分子對接研究，結果發(fā)現(xiàn)SeriesⅠANNRTIs衍生物與RT的結合模式更加類似于TMC125，而SeriesⅠB雜合體NNRTIs與RT的結合模式基本與R221239相一

9、致，與構效關系研究的結論相互印證。
　　我們對DAPY-IOPY雜合體NNRTIs體外抗HIV-1ⅢB活性最好的4個化合物，進行了進一步的活性研究。在臍帶血單個核細胞系(cordbloodmononuclearcells，CBMC)的抗HIV-1活性測試表明，ⅠA-7d、ⅠA-7c、ⅠB-7a和ⅠB-7b對病人體內分離的原始R5毒株和R4毒株的活性處于亞微摩爾級;ELISA雙抗夾心法抗HIV-1逆轉錄酶活性測試顯示，化合物ⅠA-7

10、d和ⅠA-7c對RT的抑制活性分別為5.2μM和39μM;定量PCR分析MT-4細胞單輪感染HIV-1NL4-3毒株后細胞內病毒總DNA含量表明，化合物ⅠA-7d、ⅠA-7c、ⅠB-7a或ⅠB-7b濃度為10μM時，對病毒逆轉錄晚期DNA產物的抑制率達99.2％，88.6％，98.3％和97.5％，驗證了本研究所設計DAPY-IOPY雜合化合物的通過抑制RT逆轉錄過程而發(fā)揮抗HIV-1活性。
　　本論文第二部分研究根據(jù)DAPY類化

11、合物與NNIBP晶體結構的解析和分子對接模擬研究，在對NNIBP中可容納區(qū)域Ⅰ和可容納區(qū)域Ⅱ兩個結構修飾有利位點的契合適配性分析基礎上，通過在吡啶類DAPY衍生物的右翼芳環(huán)和中心吡啶環(huán)之間插入哌啶胺極性基團，并在右翼末端芳環(huán)上引入-SONH2等極性基團，以開發(fā)與NNIBP中可容納區(qū)域Ⅰ周圍氨基酸殘基的氫鍵作用力，并改善藥物溶解度，設計了一系列具有哌啶胺柔性側鏈的吡啶類DAPY衍生物(SeriesⅡA)。同時，本研究在嘧啶和吡啶類DAPY

12、衍生物的中心雜環(huán)和右翼芳環(huán)上位于NNIBP可容納區(qū)域Ⅰ和可容納區(qū)域Ⅰ的位置，引入水溶性較高的嗎啉或哌嗪基團，設計了第二系列嗎啉和哌嗪基團修飾的吡啶和嘧啶類DAPY衍生物(SeriesⅡB)，并分別用分子對接研究驗證了SeriesⅡA和SeriesⅡB化合物設計的合理性。
　　對定向合成得到的兩個系列29個化合物的體外抗HIV-1病毒活性測試結構表明，化合物ⅡA-8c2，ⅡA-8c3，ⅡA-8c4和ⅡA-8b3抑制HIV-1NL4-

13、3毒株的EC50值分別為0.1nM、0.05nM、0.8nM和0.3nM(SI=20349-242800);對HIV-1ⅢB野生毒株的活性分別為9.1nM、7.4nM、9.3nM和7.8nM(SI=168-1283)，遠遠好于上市藥物NVP、3TC與DLV(EC50=0.29μM，3.1μM，0.61μM)，并與上市藥物ETV、AZT和EFV的活性(EC50=7.0nM，6.8nM，9.5nM)相當。此外，化合物ⅡA-8b2、ⅡA-8b

14、3對具有嚴重耐藥性的RES056(K103N+Y181C)毒株也表現(xiàn)出一定的活性(EC50=6.2μM，6.8μM)。SeriesⅡA衍生物的構效關系研究表明，左翼苯環(huán)上取代基R1對活性的貢獻順序為4-CN-2，6-二甲基＞2，4，6-三甲基;毗啶環(huán)6位取代基R3對活性的貢獻順序為Cl＞OCH3;右翼哌啶胺基團N1位取代基R2對活性的貢獻順序為4-SO2NH2-苯基＞4-SO2Me-苯基＞吡啶-4-基＞4-CONH2-苯基＞苯基＞環(huán)丙基

15、或環(huán)丁基。SeriesⅡB化合物的抗病毒活性結果表明，在NNIBP的可容納區(qū)域Ⅰ和Ⅱ引入水溶性較好的嗎啉或者哌嗪基團，基本上可以保持先導化合物原有的活性。該系列活性最好的化合物ⅡB-8b抑制HIV-1NL4-3毒株的EC50值為9.1nM(SI=2596)，同時有望具有改善的藥代動力學性質。
　　本論文第三部分工作是在本課題組前期N2，N4-雙取代-吡咯[1，2-b][1，2，4，6]噻三嗪-1，1，3-三酮衍生物(PTTDs)研

16、究的基礎上，進一步探討該類化合物N2位上多樣性取代基引入對構效關系的影響(SeiresⅢ)。本研究嘗試對PTTD類化合物合成采用了新的合成路線，闡明了其可能的反應機制。對所合成PTTD類目標化合物進行了體外抗HIV活性試驗。結果表明化合物ⅢB-10a10具有抗野生型HIV-1毒株的活性，其N2位的3，5-二甲基丙烯基為已報道的多種活性NNRTI分子結構中的普遍存在的優(yōu)勢基團。分子對接研究顯示，ⅢB-10a10N2位上的3，5-二甲基丙烯

17、基與TIBO化合物的3，5-二甲基丙烯基在NNIBP中的位置基本疊合，都處于Y181和Y188形成疏水亞口袋中。該研究結果體現(xiàn)了NNRTIs優(yōu)勢結構片段的類似性和結合模式的類似性之間具有內在聯(lián)系，為下一步繼續(xù)基于NNRTIs的分子結構多樣性以及結合模式和優(yōu)勢結構基團的類似性，進行PTTD類衍生物的結構優(yōu)化提供了重要思路。
　　綜上所述，本課題設計以先導化合物/RT復合物的三維結構解析和構效關系為研究起點，充分考慮先導化合物與結構多

18、樣的NNRTIs藥效團上類似性，以優(yōu)勢結構片段為導向，變換中心雜環(huán)的骨架結構、修飾側鏈取代基及邊鏈，以開發(fā)與RT結合位點的附加作用力，并提高溶解度;藥物設計綜合運用生物電子等排體、分子雜合、片段遷移等經(jīng)典藥物設計手段，并與計算機輔助藥物設計的應用相結合。最后經(jīng)定向合成了三個系列75個化合物，經(jīng)過活性測試發(fā)現(xiàn)了多個抗HIV-1活性達到納摩爾甚至皮摩爾水平的抑制劑，并有3個化合物(ⅠB-7a、ⅡA-8b2、ⅡA-8b3)對多藥耐藥毒株RES