東北虎胎盤microRNA表達譜、轉錄組及microRNA-424調節(jié)MAPK通路分子機制研究.pdf

1、胎盤是哺乳動物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內膜聯(lián)合長成的母子間交換物質的過渡性器官，具有物質交換、防御、合成和免疫等功能。隨著東北虎基因組數(shù)據(jù)的公布，東北虎表觀遺傳學成為一個可開拓的前沿領域。MicroRNA是一類由內源基因編碼的長度約為18～25個核苷酸(nt)的非編碼單鏈RNA分子，其主要參與基因轉錄后的表達調控。本研究應用高通量測序技術對東北虎胎盤組織進行microRNA表達譜及轉錄組分析，并對胎盤組織特異microRNA進行功

2、能驗證，得到以下結論:
　　1、利用RNA-seq技術對東北虎胎盤組織進行small RNA測序，去除接頭和低質量序列后，將 clean reads與東北虎基因組（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=tiger）進行比對、注釋及表達分析。獲得東北虎胎盤組織microRNA表達譜，其中包括465個microRNA，經聚類分析分為41個簇(cluster)和35個家族(family)，其中胎

3、盤組織特異性的microRNA有microRNA-424，microRNA-450，microRNA-495，microRNA-376a，microRNA-184，microRNA-369和microRNA-503，利用TAM tools(http://www.cuilab.cn/tam)進行功能分析，其功能主要包括胎兒生長發(fā)育、血管生成、骨再生、肌肉發(fā)育、凋亡與抗凋亡、細胞增殖與分化、粒細胞生成、免疫反應應答和激素分泌調節(jié)等。

4、　　2、對東北虎胎盤組織轉錄組進行生物學分析，包括其表達基因的GeneOntology(GO)和Clusters of Orthologous Groups of proteins(COG)分析。其中21103條東北虎基因在GO分析中被注釋到45個GO terms，有8462條基因在COG中被注釋、分類。利用靶基因預測工具TargetScan和miRanda對靶基因在東北虎胎盤組織轉錄組上進行預測，獲得東北虎胎盤組織microRNA調控

5、靶基因，描述了microRNA靶基因在胎盤組織中生物學功能，同時繪制了microRNA調控靶基因實現(xiàn)胎盤組織功能的分子網絡圖。
　　3、選取胎盤組織中特異的microRNA，利用Real time PCR、組織原位雜交和Westen blotting分析microRNA-424及其靶基因MAP2K1在東北虎和家貓?zhí)ケP組織中的表達，結果顯示東北虎胎盤組織中microRNA-424的表達顯著低于家貓?zhí)ケP組織（**p＜0.01），而其靶

6、基因MAP2K1的表達在東北虎胎盤組織中顯著高于家貓?zhí)ケP組織（**p＜0.01）。
　　4、通過靶位點突變及雙熒光素酶分析得出MAP2K13'UTR區(qū)域microRNA-424靶位點突變后，熒光素酶活性無顯著差異，而未突變組熒光素酶活性顯著下調（**p＜0.01），證實microRNA-424可直接靶向結合MAP2K13'UTR區(qū)域，并在東北虎成纖維細胞中過表達microRNA-424后，Westen blotting證實micr

7、oRNA-424可顯著下調MAP2K1的蛋白表達量（**p＜0.01）。為驗證microRNA-424在東北虎成纖維細胞中的生物學功能，Westen blotting評估侵染microRNA-424病毒顆粒后的東北虎成纖維細胞MAP2K1基因下游ERK1/2的磷酸化及蛋白表達量，MTT法評定東北虎成纖維細胞增值能力，結果證實，microRNA-424不但直接調節(jié)MAP2K1的轉錄表達，同時影響下游ERK1/2的表達，從而起到抑制細胞增殖