MicroRNA在子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、子癇前期（Preeclampsia,PE）是人類妊娠期特有的常見(jiàn)病和多發(fā)病。在我國(guó)，其發(fā)生率為9.7％，在孕產(chǎn)婦死亡原因中占第二位，嚴(yán)重威脅母嬰健康。目前，PE的病因和發(fā)病機(jī)理仍未闡明，研究表明胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙是PE發(fā)病的病理基礎(chǔ)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯，從而在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。最近有研究表明在

2、人類子癇前期胎盤(pán)與正常胎盤(pán)組織中，miR-210與miR-182的表達(dá)水平存在差異，提示miRNA的表達(dá)失衡可能參與了PE的發(fā)病過(guò)程。但以往研究檢測(cè)的miRNA數(shù)量有限，并且國(guó)內(nèi)外尚無(wú)miRNA在PE胎盤(pán)組織中功能研究的報(bào)告。因此有必要深入開(kāi)展miRNA在PE胎盤(pán)組織中的表達(dá)和功能研究，為深入研究PE的發(fā)病機(jī)理提供新的線索。
　　目的
　　1.了解miRNA在正常與PE胎盤(pán)組織中的表達(dá)差異，進(jìn)一步篩選與PE發(fā)病相關(guān)的miRN

3、A。
　　2.了解miRNA的作用靶點(diǎn)以及對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控作用，探討miRNA在PE發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法
　　1.應(yīng)用Exiqon8.1版的miRNA表達(dá)譜芯片篩選8對(duì)重度PE胎盤(pán)與正常胎盤(pán)組織中差異表達(dá)的miRNA，并采用TargetScan與PITA預(yù)測(cè)系統(tǒng)篩選差異miRNA的靶基因。
　　2.選取10個(gè)miRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（Real-timeRT-PCR）方法加以驗(yàn)證，分

4、別定量檢測(cè)miRNA在15例重度子癇前期患者（sPE組）、8例輕度子癇前期患者（mPE組）及11例正常妊娠胎盤(pán)組織（對(duì)照組）中的表達(dá)水平。
　　3.選擇PE與正常胎盤(pán)組織中表達(dá)差異較為顯著的miR-152進(jìn)行靶基因驗(yàn)證。采用miRNA過(guò)表達(dá)技術(shù)在人滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系（JEG-3）中過(guò)表達(dá)miR-152，RT-PCR與免疫印跡（Westernblot）技術(shù)驗(yàn)證其靶基因的表達(dá)水平，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證其作用位點(diǎn)。
　

5、　4.在JEG-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-152，檢測(cè)JEG-3細(xì)胞浸潤(rùn)能力的變化，并檢測(cè)NK-92MI細(xì)胞殺傷JEG-3細(xì)胞的能力是否改變。
　　結(jié)果
　　1.芯片結(jié)果顯示：重度子癇前期胎盤(pán)與正常胎盤(pán)組織中存在34個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中，11個(gè)miRNA在sPE胎盤(pán)組織中表達(dá)升高，23個(gè)miRNA表達(dá)下降。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：在miR-30a-3p、miR-152與miR-18a的可能的作用靶點(diǎn)中，分別包括IGF1、HL

6、A-G與ESR1等與PE發(fā)病相關(guān)的基因。
　　2.選取10個(gè)miRNA，應(yīng)用Real-timeRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，其中8個(gè)miRNA與芯片結(jié)果相符：miR-210、miR-152與miR-518b在sPE胎盤(pán)中表達(dá)升高（P<0.05），miR-377、miR-411、miR-542-3p、miR-18a與miR-363在sPE胎盤(pán)中表達(dá)下降（P<0.05）；miR-152在mPE胎盤(pán)組織中表達(dá)升高（P<0.05），miR-210

7、、miR-377、miR-411在mPE中表達(dá)下降（P<0.05）。
　　3.將pre-miR-152轉(zhuǎn)染入JEG-3細(xì)胞，使JEG-3細(xì)胞中的miR-152表達(dá)升高，RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后JEG-3細(xì)胞中HLA-GmRNA的水平無(wú)顯著差異（P>0.05），但Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)在JEG-3中過(guò)表達(dá)miR-152之后，HLA-G的蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）。采用pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)

8、行靶點(diǎn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pre-miR-152與重組載體的實(shí)驗(yàn)組其熒光素酶活性下降約47％，表明HLA-G為miR-152的作用靶點(diǎn)。
　　4.細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-152前后，JEG-3細(xì)胞的浸潤(rùn)能力無(wú)顯著改變（P>0.05）。然而，在JEG-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-152之后，NK-92MI細(xì)胞對(duì)JEG-3細(xì)胞的殺傷能力顯著提高（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1.子癇前期胎盤(pán)組織中存在一系列表達(dá)失衡的miR