致心律失常性右室心肌病microRNA的表達譜及調控機制研究.pdf

1、致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic right verricular cardiomypathyARVC)是原發(fā)性遺傳性心肌病，以右室心肌不同程度地被纖維脂肪組織代替為主要特征，往往伴有心室擴大，心力衰竭，嚴重惡性心律失常甚至猝死發(fā)生，是青少年及運動員猝死的主要病因。流行病學調查分析人群中發(fā)病率為1/2000～1/5000。一半以上的ARVC病例是由橋粒基因突變所引發(fā)的，最常見的橋?；蛲蛔?yōu)?plakoglobin(

2、PG), desmoplakin(DSP), plakophilin-2(PKP2), desmoglein-2(DSG2) anddesmocollin-2(DSC2)。非橋?；蛲蛔兊幕蛴修D錄因子β3（transforming growthfactor-β3 TGF-β3）和連接蛋白(connexin43 Cx43)。
　　Wnt/β-catenin和Hippo信號通路是與心臟發(fā)育相關的重要通路。Wnt/β-catenin信

3、號通路調控心臟祖細胞向心肌細胞和脂肪細胞分化。研究發(fā)現(xiàn)通過沉默DSP基因表達，會導致PG(γ-catenin)從細胞橋粒組合中脫落，從而和β-catenin共同競爭入核，進而引起核內脂肪轉化相關的轉錄因子PPARγ、C/EBP改變，從而促進脂肪分化。Wnt/β-catenin和Hippo信號通路有交互作用，兩條通路中YAP，PG及β-catenin相互作用形成蛋白復合體。在橋?；騊KP2突變的情況下，激活NF2引起Hippo信號通路的

4、重要因子MST1/2，LATS1/2及YAP發(fā)生激酶的級聯(lián)反應，通過一系列磷酸化，阻止YAP入核發(fā)揮作用，Hppo信號通路激活，發(fā)揮抑制Wnt通路作用，從而引起核內轉錄因子改變促進細胞脂肪化。因而，Hippo通路和Wnt通路可能共同參與了ARVC的發(fā)病。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在心血管疾病的各種病理生理過程中發(fā)揮了重要的調控作用，研究表明microRNA調控心臟的發(fā)育和功能，在許多心血管疾病如急性心肌梗死、肥厚型心肌

5、病、心力衰竭、動脈粥樣硬化等疾病中，microRNA都扮演了重要的角色。microRNA參與許多通路的調控而發(fā)揮作用，也參與了Wnt/β-catenin和Hippo信號通路調控疾病的病理生理過程。然而microRNA與ARVC的研究報道尚少，我們推測ARVC的發(fā)病過程，可能有microRNA的調控參與。
　　目的：
　　探討microRNA與ARVC發(fā)病機制的關系，明確microRNA在ARVC心肌病中的表達譜及microR

6、NA可能通過Hippo信號通路調控ARVC發(fā)病機制，為ARVC致病機制研究及臨床診斷治療提供依據(jù)和方向。
　　方法和結果：
　　本研究中應用qRT-PCR檢測技術S-Poly(A)Plus對24例ARVC患者心臟移植后的心肌組織樣本microRNA進行了檢測，共檢測1078個人類microRNA，同時以24例正常心肌組織樣本作為對照。通過檢測發(fā)現(xiàn)24個表達異常的microRNA，并進一步在單獨樣品中進行了驗證，結果發(fā)現(xiàn)有12

7、個microRNA表達上調，11個microRNA表達下調。進一步應用ROC曲線分析，對每一個microRNA的敏感性和特異性進行分析，排除兩個microRNA: miR-451 a、miR-3647。應用microRNA靶基因軟件進行預測顯示:21個表達異常microRNA中，miR-21-5p與YAP基因的3'UTR具有潛在結合位點;miR-135b靶向MoB1b及LATS2兩個基因，分析了miR-21-5p、miR-135b在Wn

8、t、Hippo信號通路中的靶基因，并繪制了micro RNA-Gene網(wǎng)絡圖。通過對ARCV心肌組織microRNA表達譜研究，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、 miR-135b可能調節(jié)Wn及Hippo信號通路，調控細胞脂肪化形成。
　　對miR-21-5p、miR-135b的靶基因和調控機制進一步研究，在HL-1PKP2:sb.RNA細胞模型中檢測發(fā)現(xiàn)miR-21-5p表達上調，而miR-135b表達下調。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果證實

9、miR-21-5p、miR-135b可以分別結合到靶基因mRNA的3'UTR端。在HL-1細胞中轉染miR-21-5p過表達使得YAP蛋白表達受到抑制;同樣過表達miR-135b時MoB1b及LATS2的蛋白表達量降低。細胞功能研究時，HL-1PKP2:shRNA細胞過表達miR-21-5p會促進細胞的脂肪分化，而miR-135b則會抑制心肌細胞脂肪分化，證實了miR-21-5p、miR-135b在Hippo信號通路中的調控功能。細胞學

10、功能研究證實miR-21-5p促進心肌細胞脂肪形成，而miR-135b起到抑制作用。進一步研究證實YAP為miR-21-5p的靶基因，miR-135b則靶向MoB1b及LATS2。
　　結論：
　　本實驗應用qRT-PCR檢測技術S-Poly(T)完成了ARVC患者的心肌組織microRNA表達譜研究，實驗證實microRNA參與ARCV的發(fā)育和發(fā)病機制，構建了miR-21-5p、miR-135b與Wnt及Hippo信號通路