致心律失常性右室心肌病microRNA的表達(dá)譜及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic right verricular cardiomypathyARVC)是原發(fā)性遺傳性心肌病，以右室心肌不同程度地被纖維脂肪組織代替為主要特征，往往伴有心室擴(kuò)大，心力衰竭，嚴(yán)重惡性心律失常甚至猝死發(fā)生，是青少年及運(yùn)動(dòng)員猝死的主要病因。流行病學(xué)調(diào)查分析人群中發(fā)病率為1/2000～1/5000。一半以上的ARVC病例是由橋?；蛲蛔兯l(fā)的，最常見的橋?；蛲蛔?yōu)?plakoglobin(

2、PG), desmoplakin(DSP), plakophilin-2(PKP2), desmoglein-2(DSG2) anddesmocollin-2(DSC2)。非橋?；蛲蛔兊幕蛴修D(zhuǎn)錄因子β3（transforming growthfactor-β3 TGF-β3）和連接蛋白(connexin43 Cx43)。
　　Wnt/β-catenin和Hippo信號(hào)通路是與心臟發(fā)育相關(guān)的重要通路。Wnt/β-catenin信

3、號(hào)通路調(diào)控心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默DSP基因表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致PG(γ-catenin)從細(xì)胞橋粒組合中脫落，從而和β-catenin共同競(jìng)爭(zhēng)入核，進(jìn)而引起核內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBP改變，從而促進(jìn)脂肪分化。Wnt/β-catenin和Hippo信號(hào)通路有交互作用，兩條通路中YAP，PG及β-catenin相互作用形成蛋白復(fù)合體。在橋?；騊KP2突變的情況下，激活NF2引起Hippo信號(hào)通路的

4、重要因子MST1/2，LATS1/2及YAP發(fā)生激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)一系列磷酸化，阻止YAP入核發(fā)揮作用，Hppo信號(hào)通路激活，發(fā)揮抑制Wnt通路作用，從而引起核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子改變促進(jìn)細(xì)胞脂肪化。因而，Hippo通路和Wnt通路可能共同參與了ARVC的發(fā)病。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在心血管疾病的各種病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，研究表明microRNA調(diào)控心臟的發(fā)育和功能，在許多心血管疾病如急性心肌梗死、肥厚型心肌

5、病、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中，microRNA都扮演了重要的角色。microRNA參與許多通路的調(diào)控而發(fā)揮作用，也參與了Wnt/β-catenin和Hippo信號(hào)通路調(diào)控疾病的病理生理過(guò)程。然而microRNA與ARVC的研究報(bào)道尚少，我們推測(cè)ARVC的發(fā)病過(guò)程，可能有microRNA的調(diào)控參與。
　　目的：
　　探討microRNA與ARVC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，明確microRNA在ARVC心肌病中的表達(dá)譜及microR

6、NA可能通過(guò)Hippo信號(hào)通路調(diào)控ARVC發(fā)病機(jī)制，為ARVC致病機(jī)制研究及臨床診斷治療提供依據(jù)和方向。
　　方法和結(jié)果：
　　本研究中應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)S-Poly(A)Plus對(duì)24例ARVC患者心臟移植后的心肌組織樣本microRNA進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)1078個(gè)人類microRNA，同時(shí)以24例正常心肌組織樣本作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)24個(gè)表達(dá)異常的microRNA，并進(jìn)一步在單獨(dú)樣品中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12

7、個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，11個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步應(yīng)用ROC曲線分析，對(duì)每一個(gè)microRNA的敏感性和特異性進(jìn)行分析，排除兩個(gè)microRNA: miR-451 a、miR-3647。應(yīng)用microRNA靶基因軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示:21個(gè)表達(dá)異常microRNA中，miR-21-5p與YAP基因的3'UTR具有潛在結(jié)合位點(diǎn);miR-135b靶向MoB1b及LATS2兩個(gè)基因，分析了miR-21-5p、miR-135b在Wn

8、t、Hippo信號(hào)通路中的靶基因，并繪制了micro RNA-Gene網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)對(duì)ARCV心肌組織microRNA表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、 miR-135b可能調(diào)節(jié)Wn及Hippo信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞脂肪化形成。
　　對(duì)miR-21-5p、miR-135b的靶基因和調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步研究，在HL-1PKP2:sb.RNA細(xì)胞模型中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-21-5p表達(dá)上調(diào)，而miR-135b表達(dá)下調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)

9、miR-21-5p、miR-135b可以分別結(jié)合到靶基因mRNA的3'UTR端。在HL-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-5p過(guò)表達(dá)使得YAP蛋白表達(dá)受到抑制;同樣過(guò)表達(dá)miR-135b時(shí)MoB1b及LATS2的蛋白表達(dá)量降低。細(xì)胞功能研究時(shí)，HL-1PKP2:shRNA細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-21-5p會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的脂肪分化，而miR-135b則會(huì)抑制心肌細(xì)胞脂肪分化，證實(shí)了miR-21-5p、miR-135b在Hippo信號(hào)通路中的調(diào)控功能。細(xì)胞學(xué)

10、功能研究證實(shí)miR-21-5p促進(jìn)心肌細(xì)胞脂肪形成，而miR-135b起到抑制作用。進(jìn)一步研究證實(shí)YAP為miR-21-5p的靶基因，miR-135b則靶向MoB1b及LATS2。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)S-Poly(T)完成了ARVC患者的心肌組織microRNA表達(dá)譜研究，實(shí)驗(yàn)證實(shí)microRNA參與ARCV的發(fā)育和發(fā)病機(jī)制，構(gòu)建了miR-21-5p、miR-135b與Wnt及Hippo信號(hào)通路