SUMO化修飾對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景
　　近年來(lái),流行病學(xué)調(diào)查顯示,世界范圍內(nèi)的糖尿病發(fā)病率由2％上升到5%。特別是在一些發(fā)展中國(guó)家,例如中國(guó),經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展伴隨著生活模式和生活環(huán)境的變化,使糖尿病的發(fā)病率每年增長(zhǎng)3%。1型糖尿病(type1diabetes,T1D)又名胰島素依賴型糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病,是兒童與青少年常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病。1型糖尿病是易感個(gè)體在環(huán)境因素的誘導(dǎo)下,由Th1細(xì)胞介導(dǎo),以免疫性胰島炎和胰島β細(xì)胞受損為主要特征的自身免疫

2、性疾病。2型糖尿病主要發(fā)生于成人,是由于體內(nèi)高糖高脂毒性對(duì)β細(xì)胞的長(zhǎng)期損害所致,表現(xiàn)為胰島素抵抗和肥胖。外源性胰島素治療不能像自身分泌的內(nèi)源性胰島素那樣精確地調(diào)節(jié)血糖水平,所以,糖尿病患者常伴有多種并發(fā)癥:糖尿病腎病、酮癥酸中毒、非酮癥性高滲性昏迷、糖尿病性心臟病、糖尿病性腦血管病變、糖尿病性肢端壞疽、糖尿病性神經(jīng)病變等。并且,糖尿病病情遷延,難以根除,需長(zhǎng)期用藥,導(dǎo)致家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)沉重。我國(guó)用于治療糖尿病的醫(yī)療支出約占醫(yī)療衛(wèi)生總費(fèi)用4

3、%~5%。
　　1型和2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,但大量的研究證實(shí)氧化應(yīng)激(Oxidativestress)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)在β細(xì)胞損壞導(dǎo)致糖尿病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致β細(xì)胞損傷、凋亡的主要病理基礎(chǔ)。在正常狀態(tài)下機(jī)體可產(chǎn)生少量活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS),同時(shí)存在自由基清除體系,使自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡。少量活性氧自由基參與代謝,如細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細(xì)

4、胞的生長(zhǎng)、分裂、分化、遷移、凋亡及衰老等生理活動(dòng),但過(guò)多活性氧自由基可導(dǎo)致組織、細(xì)胞發(fā)生病理改變,造成的機(jī)體傷害。胰腺β細(xì)胞抗氧化防御能力低下,細(xì)胞內(nèi)自由基清除酶(Cu/Zn超氧化物歧化酶、Mn超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)和ROS清除蛋白(硫氧化還原蛋白)水平較低,使較低的氧自由基濃度即可使胰腺β細(xì)胞受損。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致β細(xì)胞損傷、凋亡的另一個(gè)重要機(jī)制。β細(xì)胞作為內(nèi)分泌細(xì)胞,擁有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng),同

5、時(shí)也使β細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激高度敏感。在氧化應(yīng)激等情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多,發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)(Unfoldproteinresponse,UPR),該反應(yīng)首先激活膜上的3個(gè)信號(hào)蛋白:PERK(PKR-likeERkinase,雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶),IRE-1(inositolrequiringenzyme1,跨膜蛋白激酶1)和ATF6(Activatingtranscriptionfactor6,活化轉(zhuǎn)錄因子6),通

6、過(guò)其下游信號(hào)通路抑制蛋白質(zhì)的合成,上調(diào)分子伴侶和折疊蛋白的表達(dá),加速未折疊蛋白的降解等多種方式緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)UPR超過(guò)細(xì)胞的承受能力,使細(xì)胞不能重新回到穩(wěn)態(tài)時(shí),則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。通過(guò)CHOP通路、IRE1-TRAF2-ASK1-caspase12通路和Ca2+通路,使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致β細(xì)胞損傷是引發(fā)及推動(dòng)1型和2型糖尿病的重要環(huán)節(jié),兩者分別/共同作用,使β細(xì)胞失去分泌胰島素的功能。本課題組的

7、前期及其它課題組研究結(jié)果顯示,在氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,SUMO高表達(dá),多種抵抗應(yīng)激的蛋白被SUMO化,顯示蛋白SUMO化是一種重要的轉(zhuǎn)錄后抵抗應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　SUMO化修飾過(guò)程與泛素化類似,包含E1活化酶,E2結(jié)合酶以及E3連接酶三個(gè)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。E1活化酶是一種異源二聚體,在哺乳動(dòng)物中為SAE1/SAE2,E2結(jié)合酶為UBC9,UBC9是SUMO化修飾中唯一的E2結(jié)合酶,UBC9的表達(dá)變化直接影響到SUMO化功能,因

8、此,UBC9是研究β細(xì)胞SUMO化功能的良好靶點(diǎn)。UBC9基因缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡。E3酶主要包括三類:PIAS家族、核孔蛋白R(shí)anBP2/Nup358和Pc2。通過(guò)三種酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)SUMO分子被轉(zhuǎn)移至底物蛋白。
　　本研究以UBC9為靶點(diǎn),以誘導(dǎo)型條件性UBC9基因敲除小鼠,在成年小鼠β細(xì)胞內(nèi)特異性地敲除UBC9基因作為模型,研究SUMO化修飾對(duì)β細(xì)胞功能的影響,進(jìn)行了以下工作:
　　二、誘導(dǎo)型UBC9基因敲除小鼠模型

9、的建立
　　本研究用ubc9fl/fl小鼠和他莫昔芬誘導(dǎo)型β細(xì)胞特異性RipCreER轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交,建立RipCreER+ubc9fl/fl小鼠。對(duì)8周齡RipCreER+ubc9fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬(50mg/kg/天),每天一次,連續(xù)5天,以注射玉米油溶劑(含10%乙醇)的同窩同性別小鼠作為對(duì)照,誘導(dǎo)成年小鼠的β細(xì)胞UBC9基因敲除。注射完成5天后處死小鼠,由膽總管向胰腺注入膠原酶P,消化挑揀胰島。提取胰島的D

10、NA和蛋白,進(jìn)行PCR和Westernblot分析胰島的基因組型別及UBC9的表達(dá),驗(yàn)證基因敲除效果。結(jié)果顯示:對(duì)照組小鼠胰島UBC9基因完整,表達(dá)UBC9蛋白高,而他莫昔芬組誘導(dǎo)組胰島中染色體UBC9基因部分缺失,未檢出UBC9蛋白表達(dá),表明他莫昔芬誘導(dǎo)后,RipCreER+ubc9fl/fl小鼠UBC9表達(dá)缺失;并且雌性小鼠的誘導(dǎo)完全缺失的比率為50%,雄性小鼠的誘導(dǎo)完全缺失的比率為75%。
　　三、UBC9缺失導(dǎo)致小鼠早期發(fā)

11、生糖耐量異常,晚期罹患1型糖尿病
　　1、UBC9基因敲除小鼠早期發(fā)生糖耐量異常
　　(1)UBC9基因敲除小鼠糖耐量降低:他莫昔芬或玉米油注射完畢后第9天(D9)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前小鼠空腹16小時(shí),腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液后于0min、30min、60min、90min、120min和180min采集小鼠尾部血樣檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的血糖值。結(jié)果顯示:①他莫昔芬組小鼠空腹血糖值較對(duì)照油組明顯降低;②對(duì)照組小鼠血糖30mi

12、n升到峰值,60min迅速下降,90min基本恢復(fù)到正常,而他莫昔芬組小鼠血糖30min峰值明顯升高,60-120min血糖緩慢下降,180min時(shí)尚未恢復(fù)正常。
　　(2)UBC9基因敲除小鼠胰島素耐受正常:胰島素的分泌減少與胰島素抵抗均可造成糖耐量下降,為了進(jìn)一步明確他莫昔芬組引起糖耐量下降的原因,我們比較了兩組小鼠的胰島素耐受情況。腹腔注射0.75U/kg胰島素,于注射后0min、15min、30min、45min和60mi

13、n檢測(cè)血糖。結(jié)果顯示:兩組小鼠0min的隨機(jī)血糖值無(wú)差異,30min時(shí)血糖均降到最低點(diǎn),60min時(shí)血糖基本恢復(fù)正常,各時(shí)間點(diǎn)組間差異不顯著。
　　以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明:胰島β細(xì)胞特異性UBC9基因缺失導(dǎo)致β細(xì)胞分泌胰島素的功能明顯下降,造成糖耐量異常。
　　2、UBC9基因敲除小鼠晚期血糖自發(fā)升高,血清胰島素水平下降,出現(xiàn)自發(fā)糖尿病
　　(1)UBC9基因敲除小鼠平均血糖值升高:監(jiān)測(cè)他莫昔芬組和對(duì)照組小鼠的隨機(jī)血糖值,一

14、周2次。D7到D42天兩組小鼠平均血糖持續(xù)在正常水平,他莫昔芬組血糖略高于對(duì)照組,但組間差異不顯著;D42天之后,他莫昔芬組血糖值持續(xù)上升,D70天達(dá)478.6±12.4mg/dl,較對(duì)照組166.3±6.0mg/dl明顯升高。
　　(2)UBC9基因敲除小鼠血清胰島素水平下降:采集小鼠心臟血液,ELISA檢測(cè)血清胰島水平,與對(duì)照組相比,他莫昔芬組小鼠血清胰島素水平在D45天之后明顯下降。
　　(3)UBC9基因敲除小鼠糖尿

15、病晚期發(fā)病率100%:他莫昔芬組小鼠在D43天開(kāi)始出現(xiàn)血糖異常,D55天有66.7%小鼠血糖達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn),D65天所有小鼠均出現(xiàn)血糖異常和糖尿病相關(guān)癥狀,而對(duì)照組小鼠無(wú)1例發(fā)病。
　　以上結(jié)果顯示:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺失可導(dǎo)致胰島素分泌水平下降,造成血糖升高,長(zhǎng)時(shí)間血糖升高在晚期造成小鼠罹患糖尿病。
　　四、UBC9缺失導(dǎo)致胰島形態(tài)和功能異常,β細(xì)胞發(fā)生凋亡
　　1、胰腺組織內(nèi)胰島團(tuán)變小,數(shù)目減少:小鼠胰腺石蠟

16、切片HE染色示:對(duì)照組胰腺組織胰島團(tuán)大而圓,胞漿胞核著色均勻;他莫昔芬組胰島團(tuán)隨著UBC9敲除時(shí)間的后移逐漸變小,并出現(xiàn)凋亡小體。胰島素免疫組化染色和免疫熒光染色示:對(duì)照組胰島素陽(yáng)性染色的β細(xì)胞團(tuán)大、圓,占整個(gè)切片胰腺組織面積的2%左右;他莫昔芬組胰島素陽(yáng)性染色細(xì)胞團(tuán)逐漸減小,D45天僅占切片胰腺組織面積的0.9%;D75天減小到0.2%以下。結(jié)果顯示:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺失導(dǎo)致胰島β細(xì)胞形態(tài)異常,數(shù)量減少。
　　2、胰島細(xì)

17、胞功能異常:膠原酶P消化獲得胰島,體外培養(yǎng)過(guò)夜,進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)胰島在低糖(3.3mM)和高糖(16.7mM)刺激下胰島素的釋放量。他莫昔芬組胰島分泌能力明顯下降。
　　3、胰島內(nèi)β細(xì)胞發(fā)生凋亡:TUNEL和cleavedcaspase3染色檢測(cè)顯示他莫昔芬組D45天左右胰島內(nèi)2.3%的β細(xì)胞發(fā)生凋亡,對(duì)照組內(nèi)僅見(jiàn)0.2%的凋亡細(xì)胞,組間差異顯著。結(jié)果提示:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺失使β細(xì)胞更容易

18、發(fā)生凋亡。
　　五、UBC9缺失小鼠對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病的耐受力降低
　　他莫昔芬和對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)5天注射低劑量STZ(40mg/kg),兩組小鼠隨機(jī)血糖值均緩慢上升,他莫昔芬組血糖明顯高于對(duì)照組,上升到近600mg/dl,而對(duì)照組血糖僅上升到近400mg/dl。結(jié)果提示:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺失的β細(xì)胞對(duì)STZ耐受力明顯降低。
　　六、UBC9缺失導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　1、SUMO-NADPH氧化酶

19、-ROS途徑對(duì)β細(xì)胞凋亡的影響
　　(1)UBC9基因缺失早期β細(xì)胞內(nèi)ROS升高:UBC9基因敲除后D10天,膠原酶消化分離胰島,培養(yǎng)過(guò)夜,細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN-γ)混合刺激6小時(shí),25μM羧基-H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬組胰島內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組。結(jié)果說(shuō)明:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺陷在早期可導(dǎo)致β細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增強(qiáng)。
　　(2)UBC9基因缺失后期β細(xì)胞內(nèi)ROS降低:UBC9

20、基因敲除后D30-D45天,胰島培養(yǎng)過(guò)夜,細(xì)胞因子刺激6小時(shí),H2DCFDA中孵育30min,他莫昔芬組胰島內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。結(jié)果說(shuō)明:胰島β細(xì)胞特異性UBC9缺陷導(dǎo)致β細(xì)胞大量損傷、凋亡,在誘導(dǎo)后期胰島內(nèi)ROS表達(dá)減弱。
　　2、Ubc9基因缺陷導(dǎo)致β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　我們檢測(cè)了β細(xì)胞內(nèi)ERstress相關(guān)蛋白Grp78、Grp58、eIf2a、ATF6、IRE1a和CHOP等蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:ERst

21、ress可能介導(dǎo)了β細(xì)胞凋亡。
　　七、結(jié)論
　　1、UBC9基因缺失早期小鼠發(fā)生糖耐量異常,后期血糖升高,血清胰島素水平下降,基因敲除小鼠全部自發(fā)糖尿病;
　　2、UBC9基因缺陷導(dǎo)致小鼠胰島內(nèi)β細(xì)胞凋亡,引發(fā)胰島形態(tài)和功能異常;
　　3、UBC9基因缺陷小鼠對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病的耐受力降低;
　　4、UBC9基因缺陷小鼠β細(xì)胞內(nèi)ROS和ERstress的異常表達(dá)是導(dǎo)致β細(xì)胞損傷、凋亡的重要原因。