SUMO2-3基因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞生長的調(diào)控及在缺血神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)變化的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：目的：構(gòu)建SUMO2/3 （small ubiquitin-like modifier 2/3）基因的MicroRNA特異性干擾質(zhì)粒，為探討抑制SUMO2/3基因在細(xì)胞中表達(dá)對B35細(xì)胞的影響的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的SUMO2和SUMO3的DNA序列，首先克隆出SUMO2和SUMO3的功能性基因片段，并將基因片段連接到pcDNA3.1載體；然后分別設(shè)計對SUMO2和SUMO3基因特

2、異的miRNA片段，分別命名為miR2和miR3，同時設(shè)計一條非特異性序列作為陰性對照，命名為negative-miR，并將這些片段克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體上。通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，并對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，DNA測序鑒定。然后將pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3通過酶切和連接反應(yīng)將miR2和miR3同時連接到同一p

3、cDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體上，稱之為pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3,同時抑制SUMO2和SUMO3的表達(dá)。分別將相應(yīng)的功能基因片段和其對應(yīng)的抑制性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HT22細(xì)胞中，并用50μM H2O2作用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞10min，激活SUMO化通路的表達(dá)，用Western-Blot在蛋白水平檢測SUMO2和SUMO3化蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切和電泳證明序列成功插

4、入到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體預(yù)計位點(diǎn)，經(jīng)DNA測序進(jìn)一步證明序列完全正確。Western-Blot結(jié)果證明pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2和pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR3分別成功沉默SUMO2和SUMO3基因的表達(dá)，并且pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3能夠同時沉默SUMO2/3基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建針對SUMO2/3基因特異性的miRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)

5、染細(xì)胞后能夠明顯抑制SUMO2/3基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究其基因功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：目的：構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3及pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR質(zhì)粒的B35細(xì)胞系，觀察SUMO2/3基因沉默對細(xì)胞生長的影響，并用OGD體外缺血模型對細(xì)胞進(jìn)行處理，然后根據(jù)不同的再灌注時間觀察SUMO家族蛋白表達(dá)的變化。
　　 方法：用攜帶CMV的pcDNA6

6、.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-negative-miR轉(zhuǎn)染B35細(xì)胞系，用blasticidin篩選出穩(wěn)定株，用Western-Blot檢測SUMO2/3基因表達(dá)的改變，然后用CellTiter-Blue reagent試劑盒檢測細(xì)胞的生長速度。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用體外缺血模型OGD干預(yù)后，用Western-Blot檢測SUMO家族蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcD

7、NA6.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒的B35細(xì)胞在受到應(yīng)激刺激后，SUMO2/3蛋白表達(dá)和對照組相比明顯降低；并且其細(xì)胞生長速度和對照組相比3天后降低為對照組的64％。細(xì)胞經(jīng)過OGD作用后，對照組SUMO1蛋白的表達(dá)在0min時降低，然后升高，30min時到達(dá)高峰，然后有所降低，但趨勢并不是很明顯；SUMO2/3沉默組和對照組相比沒有明顯差別。對照組和正常細(xì)胞組SUMO2/3化蛋白表達(dá)變化為：在0min時先降低，然后逐漸升高，

8、30min達(dá)到高峰，然后逐漸降低，至3h后基本恢復(fù)正常。和對照組及正常細(xì)胞組相比，SUMO2/3沉默組的每個時間段的SUMO2/3化蛋白表達(dá)均明顯降低，各時間段表達(dá)變化不明顯。
　　 結(jié)論：SUMO2/3基因沉默后可以明顯降低細(xì)胞的生長速度；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照載體的細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR2/3質(zhì)粒載體的細(xì)胞經(jīng)OGD作用后SUMO1蛋白表達(dá)沒有明顯區(qū)別；SUMO2/3在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/E

9、mGFP-miR2/3質(zhì)粒的B35細(xì)胞中表達(dá)相對正常細(xì)胞組及對照組明顯降低，而對照組和正常細(xì)胞組相比沒有明顯區(qū)別。
　　 第三部分：目的：建立小鼠脊髓缺血的簡單易重復(fù)的動物模型，并檢測SUMO蛋白在其中表達(dá)的變化。
　　 方法：將成年雌性C57Bl/6J小鼠用異氟咪麻醉后，取右側(cè)臥位，保持肛溫在37.0±0.5oC，于胸8肋間切開1cm的切口，將一個小動脈瘤夾放置在胸主動脈的胸8部位，根據(jù)夾閉時間的不同，將小鼠分為對照組

10、、8 min、10min和12 min夾閉組，用激光多普勒探頭檢測夾閉后小鼠腰段脊髓表面血流的變化；同時對各組小鼠在缺血后1h、1d、3d、5d、7d進(jìn)行BBB評分檢查和Rotarod 檢測；在手術(shù)7天后將腰段脊髓取出包埋固定后行HE染色，對脊髓前腳的存活神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)；同時將另外一批10min夾閉組和對照組的腰段脊髓組織，用Western-Blot檢測脊髓損傷后SUMO蛋白表達(dá)的變化。為了研究本模型對小鼠長期存活的影響，我們使另一10

11、min夾閉組和對照組存活至術(shù)后28天，并對其病理生理功能進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：在8 min 缺血組，BBB 評分在1h后下降到15分，24h基本恢復(fù)正常，而10min和12 min組，BBB評分在7天時與對照組和8 min組相比均明顯降低，差距具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義；Rotarod 檢測結(jié)果和BBB評分相似，在7天時，8 min組和對照組相比沒有明顯區(qū)別，而10min或12 min組與對照組或8 min組相比差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義

12、（p＜0.01, 10min or 12 minvs. 0min or 8 min）；胸段脊髓夾閉后可以引起腰段脊髓表面血流降低到夾閉前的10％；神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)元細(xì)胞的死亡和缺血時間密切相關(guān)。長時程10min夾閉檢測組的小鼠有80％存活到28天，BBB評分和Rotarod檢測和對照組相比差異顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 結(jié)論：成功建立了小鼠的脊髓缺血模型，脊髓缺血后SUMO2/3蛋白表達(dá)和對照組相比明顯升高，這和