索拉菲尼聯(lián)合射頻消融治療肝癌的臨床和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.研究背景：
　　 肝癌目前是世界上第五大致死性癌癥。在美國和歐洲，肝癌的發(fā)病率正在不斷升高，目前已成為肝硬化患者死亡的首要原因。盡管手術(shù)切除或肝移植術(shù)被認(rèn)為是治療肝細(xì)胞癌的有效方法，但目前僅有約5％-20%的有臨床表現(xiàn)的肝癌患者適于肝臟切除。由于從肝硬化演化而來的肝癌患者的肝功能差及供體肝源短缺等原因?qū)е碌母我浦残g(shù)不能有效實(shí)施，因此手術(shù)切除仍是治療肝癌的最佳方法。但由于殘余肝臟不足等原因，肝切除術(shù)仍受到限制，特別是對于復(fù)發(fā)性

2、肝癌和嚴(yán)重肝硬化的肝癌患者。
　　 射頻消融術(shù)是目前治療肝臟腫瘤過程中應(yīng)用最廣泛的熱消融技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)包括副作用少、恢復(fù)快、腫瘤復(fù)發(fā)后可以再次使用該方法進(jìn)行治療等。然而，腫瘤血管中溫度相對較低的血流帶走熱量導(dǎo)致的“熱沉效應(yīng)”限制了射頻消融導(dǎo)致的凝固性壞死的范圍，并且，腫瘤消融的不完全已成為肝癌治療失敗的一個(gè)主要原因。不少研究著力于克服這些影響射頻消融療效的困難，一些研究已經(jīng)表明降低腫瘤的血流量可以顯著地提高射頻消融導(dǎo)致的凝固性壞

3、死的效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，降低腫瘤的血流量可以提高射頻消融導(dǎo)致的凝固性壞死的范圍，臨床研究也表明，通過阻斷門靜脈或肝動(dòng)脈的血流可以顯著提高射頻消融導(dǎo)致的凝固性壞死的范圍。由于阻斷門靜脈或肝動(dòng)脈的侵入有創(chuàng)性，所以這些方法不便用于臨床。Hines-Peralta等人證實(shí)三氧化二砷(俗稱“砒霜”，具有抗血管生成的作用)可以減少腫瘤內(nèi)的血流量，增加射頻消融導(dǎo)致的凝固性壞死的范圍。
　　 當(dāng)今索拉非尼已經(jīng)過隨機(jī)對照試驗(yàn)，成為了的用于治療進(jìn)展

4、期肝癌的常規(guī)藥物。研究表明，索拉非尼可以阻斷數(shù)種酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。三期臨床試驗(yàn)證實(shí)了索拉非尼用于治療晚期肝癌的有效性和安全性，而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也證實(shí)了索拉非尼可顯著改善晚期肝癌患者的總體生存率。
　　 因此，我們推測射頻消融術(shù)與索拉非尼的應(yīng)用相結(jié)合可以提高射頻消融的療效。
　　 2.研究目的：
　　 2.1研究證實(shí)索拉菲尼是否能延長肝癌患者的平均生存時(shí)間。對于接

5、受射頻消融的進(jìn)展期肝癌患者，索拉菲尼是否能延長射頻消融的間隔；
　　 2.2體外試驗(yàn)驗(yàn)證索拉菲尼對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及肝癌細(xì)胞系(HepG2)的影響；
　　 2.3通過體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證通過口飼索拉菲尼拮抗腫瘤血管生成，能否擴(kuò)大射頻消融引起的肝癌動(dòng)物模型腫瘤毀損面積。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法：
　　 3.1、病歷資料：收集2008年8月至2011年12月之間收治于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽外科的

6、23例不能手術(shù)切除的給予索拉非尼治療的肝癌患者病歷資料，所有患者均規(guī)范服用索拉菲尼，其中8人同時(shí)聯(lián)合射頻消融治療。所有參與本實(shí)驗(yàn)研究患者均簽署知情同意書；本項(xiàng)研究獲得本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者按照歐洲肝病協(xié)會(huì)制定的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，如不符合則通過肝穿活檢證實(shí)為肝癌。所有患者接受索拉非尼初始劑量均為400毫克，每日兩次，用藥時(shí)間大于等于12周。相關(guān)數(shù)據(jù)取自患者的臨床記錄，包括病史、生化檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果，以及其他后續(xù)相關(guān)信息記錄。

7、中位隨訪時(shí)間19.2個(gè)月。隨訪終點(diǎn)為患者死亡，第二終點(diǎn)為連續(xù)2次實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(resist標(biāo)準(zhǔn))評(píng)價(jià)為進(jìn)展。
　　 3.2、體外實(shí)驗(yàn)：肝癌HepG-2和HUVEC細(xì)胞單層培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞孵箱條件為37℃，含有5%CO2。將不同索拉菲尼處理HUVEC及HepG2后，使用3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenytetrazoliumbromide法(MT

8、T)、流式細(xì)胞儀和蛋白免疫印跡方法檢測細(xì)胞功能變化。
　　 3.3、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：雄性無胸腺裸鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)層流柜中，自由獲得水和食物。人肝癌細(xì)胞皮下植入裸鼠腋下3周后，隨機(jī)分配對照組或治療組。每個(gè)治療組每日分別經(jīng)口灌注40和80毫克每公斤體重的索拉非尼；對照組只給予同等量溶劑。索拉非尼稱重后儲(chǔ)存于避光干燥的地方，給藥前將其加熱到60度1分鐘，超聲20-30分鐘以液態(tài)形式溶解，給藥10天后終止。每日檢查小

9、鼠，每周兩次測量腫瘤大小。
　　 應(yīng)用200W內(nèi)部冷卻射頻消融系統(tǒng)(09036115，伯靈頓，馬薩諸塞州)行RFA。小鼠取仰臥位，充分麻醉后直視下，將針尖作用端為1厘米的冷循環(huán)射頻消融電極插入腫瘤，保持溫度70±5℃，持續(xù)消融5分鐘。RFA后處死小鼠，取出腫瘤，以2-3毫米厚度垂直于射頻針軸面切片，挑出最大直徑的切片。消融大小經(jīng)線粒體活性的2%氯化三苯四唑(TTC)的染色后可見，數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像。測量凝血功能區(qū)的面積，分別染色(

10、紅色，有活力的組織和白色，燒蝕組織)。所有樣品經(jīng)ImageJ軟件處理分析，計(jì)算毀損面積。所有施行射頻消融的腫瘤切片行HE染色組化檢查。每組隨機(jī)挑選6只荷瘤鼠，切取腫瘤標(biāo)本置入0.C.T.冰凍切片包埋，腫瘤切片用丙酮4℃下固定10min，山羊血清封閉，DAPI染核。Zeiss共聚焦顯微鏡觀測和采集圖像。，將腫瘤組織標(biāo)本行DAPI和CD31染色，確定腫瘤微血管密度(MVD)。將MVD與腫瘤的生長和消融結(jié)果相比較。
　　 4.試驗(yàn)結(jié)果

11、：
　　 4.1、臨床研究
　　 患者平均年齡是52.8歲(38-78歲).男女比例是19:4.所有23名患者都有乙肝后導(dǎo)致的肝硬化。其中19名患者(82.6%)的肝功能處于Child-PughA級(jí)，4名患者(17.4%)處于Child-PughB級(jí).17(73.9%)名患者肝癌分級(jí)為巴塞羅那(BCLC)分級(jí)b級(jí)，其余6名(26.1%)是C級(jí)withBCLCstageC.26.1%(6/23)的患者有門靜脈癌栓。腫瘤平均

12、直徑是5.3cm。所有患者在服用索拉菲尼之前被診斷為進(jìn)展期肝癌且無法手術(shù)，其中13%(3/23)的患者有肝外轉(zhuǎn)移。21名(91.3%)患者在索拉菲尼治療前至少接受過一種治療：15(65.2%)名患者曾行肝切除，9(39.1%)名患者曾行插管化療(transarterialchemoembolization，TACE)，14(62.9%)名患者曾行射頻。8(34.8%)名患者在服用索拉菲尼后同時(shí)行射頻治療，其它15名患者僅行索拉菲尼治療。

13、本組患者平均隨訪時(shí)間是11.78個(gè)月，總中位生存時(shí)間是9個(gè)月(95%CI，7.547-10.453)。聯(lián)合射頻和索拉菲尼治療的患者平均生存時(shí)間是28.3月(95%CI，18.5-38.2)，單用索拉菲尼的平均生存時(shí)間是8.4月(95%CI，7.1-9.6)。根據(jù)BCLC分期，BCLCB級(jí)的患者中位生存時(shí)間是11個(gè)月(95%CI，5.213-16.787)，BCLCC級(jí)的患者中位生存時(shí)間是9(95%CI，3.342-14.658)月。根據(jù)

14、Child-Pugh分級(jí)來看，ChildA級(jí)患者的中位生存時(shí)間是11個(gè)月(95%CI：6.743-15.257)，而ChildB的患者是8months(95%CI：4.733-15.257)。射頻消融患者接受索拉菲尼治療后可以延長2次射頻的間隔時(shí)間。
　　 4.2、體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 通過體外實(shí)驗(yàn)研究我們確認(rèn)索拉非尼可抑制HepG2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)索拉非尼對HepG2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的具有抗增殖效應(yīng)

15、，索拉非尼在體外可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞活力相關(guān)蛋白下調(diào)，并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞凋亡、引起細(xì)胞周期停滯。
　　 4.3、體內(nèi)試驗(yàn)研究
　　 小鼠分為3組并用不同劑量的索拉非尼(0,40至80mg/kg)處理10天。這三個(gè)小組中，腫瘤生長的差異顯著(P<0.01)。射頻誘導(dǎo)的腫瘤壞死面積的程度在索拉非尼處理的實(shí)驗(yàn)組中顯著增加。射頻凝固的面積在對照組中測量值為57.29±3.39平方毫米。索拉菲尼預(yù)處理的小鼠的腫瘤

16、，射頻凝固的面積隨劑量顯著增加。對比對照組，用索拉非尼(40和80mg/kg)預(yù)處理的小鼠的腫瘤在腫瘤血管CD31染色中有所不同。對照組腫瘤顯示Ⅲ或Ⅳ度的血管顯露而用80mg/kg的索拉菲尼預(yù)處理的小鼠腫瘤幾乎無血管分布(Ⅰ級(jí))。用40mg/kg的索拉菲尼預(yù)處理的小鼠腫瘤為Ⅱ級(jí)。用索拉非尼處理后所有的小鼠腫瘤都表現(xiàn)出腫瘤中心的血管分布極大的減少。
　　 5.研究結(jié)論：
　　 5.1、射頻消融和索拉非尼治療結(jié)合能延長進(jìn)展的