γδT細(xì)胞在幽門螺桿菌感染中的作用特點(diǎn)及機(jī)制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一種微需氧、螺旋狀革蘭陰性桿菌，主要感染定植于人體胃粘膜。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球50％以上人口都曾感染過(guò)H。pylori，其感染可導(dǎo)致慢性胃炎，繼而引起消化性潰瘍和粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)，甚至與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已被WHO列為Ⅰ類致癌因子。盡管H.pylori感染能夠引發(fā)宿主較強(qiáng)烈的固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答，但自然感染H.pylori后機(jī)體的免

2、疫反應(yīng)并不能有效清除細(xì)菌，反而由于慢性持續(xù)性感染導(dǎo)致胃粘膜免疫病理?yè)p害。目前，H.pylori慢性持續(xù)性感染機(jī)制及相關(guān)的免疫調(diào)控機(jī)制并不完全清楚。
　　 T淋巴細(xì)胞免疫在H.pylori感染所致疾病的發(fā)展進(jìn)程具有重要的作用。根據(jù)TCR雙肽鏈構(gòu)成的不同，可將T細(xì)胞分為αβ T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞兩類。αβ T細(xì)胞作為重要的效應(yīng)細(xì)胞在獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要作用，而γδ T細(xì)胞由于其分布特點(diǎn)和抗原識(shí)別特性，在機(jī)體的固有性免疫中發(fā)揮著獨(dú)

3、特的作用。γδ T細(xì)胞主要分布于腸道、呼吸道皮膚及泌尿生殖道的黏膜和皮下組織，而脾臟和淋巴結(jié)中分布較少，外周血中γδ T細(xì)胞僅占T淋巴細(xì)胞的2％～5％。粘膜組織是病原微生物入侵機(jī)體的第一道屏障，機(jī)體T細(xì)胞總庫(kù)存的一半都在粘膜組織內(nèi)。因此，γδ T細(xì)胞這一分布特點(diǎn)提示其在細(xì)菌，病毒，真菌和原蟲等病原體感染的黏膜免疫防御中都扮演著重要的角色。
　　 γδ T細(xì)胞在胃腸道粘膜大量存在，而胃粘膜正是H.pylori感染定植的主要部位，是

4、細(xì)菌入侵的第一道免疫防線。因此，γδ T細(xì)胞與H.pylori感染的關(guān)系日益受到重視，其免疫應(yīng)答狀況極可能決定了H.pylori的感染定植及相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)歸。已有研究報(bào)道，H.pylori感染患者外周血中的γδ T細(xì)胞明顯增高，并且與胃炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)，清除細(xì)菌后，γδ T細(xì)胞數(shù)量亦相應(yīng)減少。然而，γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中的應(yīng)答規(guī)律；對(duì)細(xì)菌感染定植的具體作用；對(duì)H.pylori感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制等，目前還不清楚。明

5、確這些問(wèn)題將有助于我們對(duì)H.pylori感染過(guò)程中免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的全面理解和闡述，為采取正確的免疫調(diào)控方式逆轉(zhuǎn)其慢性持續(xù)化進(jìn)程提供新的線索。
　　 研究目的:
　　 1.本研究以γδ T細(xì)胞為主要研究對(duì)象，探討其在H.pylori感染過(guò)程中的應(yīng)答規(guī)律及特點(diǎn)。
　　 2.分析γδ T細(xì)胞對(duì)H.pylori定植量和炎癥程度的影響。明確其在H.pylori感染中的作用。
　　 3.探討γδ T細(xì)胞影響H.pylo

6、ri感染定植的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制
　　 4.初步分析H.pylori感染患者外周血γδ T細(xì)胞特點(diǎn)
　　 研究方法:
　　 1.H.pylori感染過(guò)程中γδ T細(xì)胞的應(yīng)答特征
　　 建立H.pylori感染C57BL/6小鼠模型，在H.pylori感染后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，分離小鼠的脾，Peyer's結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)及小腸上皮間淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)，分析γδ T細(xì)胞的應(yīng)答規(guī)律及表型特征。細(xì)胞內(nèi)因子染色，

7、檢測(cè)γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子譜。同時(shí)，利用IL-23p19-/-敲除小鼠研究IL-23對(duì)IL-17+γδ T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　 2.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中的作用研究
　　 H.pylori感染野生型小鼠及γδ T細(xì)胞基因敲除小鼠，采用real-time PCR檢測(cè)H。pylori定植量的變化，H&E染色檢測(cè)胃組織炎癥程度。隨后，體外擴(kuò)增分選感染小鼠脾臟中的γδ T細(xì)胞。在H.pylori感染前24小時(shí)，

8、通過(guò)靜脈過(guò)繼免疫TCR-δ-/-小鼠，檢測(cè)其對(duì)細(xì)菌定植量及胃組織炎癥的影響。
　　 3.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中的作用機(jī)制探討
　　 H.pylori感染野生型小鼠及γδ T細(xì)胞基因敲除小鼠，采用流式細(xì)胞技術(shù)，分析γδT細(xì)胞缺失后機(jī)體Th細(xì)胞免疫應(yīng)答變化；抽提感染胃組織RNA，real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)變化，ELISA檢測(cè)感染小鼠血清及胃粘膜局部IgG和IgA

9、抗體水平。
　　 4.H.pylori感染患者外周血中γδ T細(xì)胞分析
　　 收集新橋醫(yī)院消化內(nèi)科H.pylori陽(yáng)性(25例)和H.pylori陰性(18例)胃炎患者的外周血標(biāo)本。采用流式細(xì)胞技術(shù)，分析γδ T細(xì)胞比例變化及細(xì)胞亞群應(yīng)答情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染過(guò)程中的應(yīng)答特征
　　 1.1感染H.pylori后，小鼠系統(tǒng)及局部免疫系統(tǒng)中γδ T細(xì)胞應(yīng)

10、答明顯增強(qiáng)，小鼠脾及腸系膜淋巴結(jié)中的γδ T細(xì)胞的比例在感染H.pylori24h后即開始明顯升高(P<0.05)，48h達(dá)到高峰。而PP結(jié)及腸上皮間淋巴細(xì)胞中γδ T細(xì)胞于感染后24h即達(dá)到峰值，并且在感染早期(7d)都維持在較高水平。
　　 1.2體外以H.pylori感染小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞。結(jié)果顯示，H.pylori活菌可明顯誘導(dǎo)γδ T細(xì)胞擴(kuò)增(P<0.05)，而甲醛固定菌株則不能誘導(dǎo)增殖。并且H.pylori這

11、種誘導(dǎo)擴(kuò)增活性與H.pylori毒力蛋白CagA和UreB無(wú)關(guān)。
　　 1.3分析γδ T細(xì)胞表型特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染后，脾臟中γδ T細(xì)胞表現(xiàn)為激活狀態(tài)，CD44，CD69和CD25的表達(dá)上調(diào)。
　　 1.4采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)應(yīng)答γδ T細(xì)胞的不同亞型，盡管Vγ1+γδ T細(xì)胞是脾淋巴細(xì)胞中主要的γδ T細(xì)胞亞型，但H.pylori感染小鼠的脾淋巴細(xì)胞中主要以Vγ4+γδ T細(xì)胞應(yīng)答為主，其比例明顯升高。而

12、相應(yīng)的Vγ1+γδ T細(xì)胞所占比例降低(P<0.05)。采用real-time PCR檢測(cè)胃粘膜局部γδ T細(xì)胞的Vγ亞型，結(jié)果表明小鼠胃粘膜主要以Vγ7+γδ T細(xì)胞為主。H.pylori感染后Vγ7水平略微升高，同時(shí)Vγ4+γδ T細(xì)胞在胃粘膜聚集，可檢測(cè)到明顯的Vγ4基因表達(dá)。
　　 1.5采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)H.pylori感染小鼠應(yīng)答γδ T細(xì)胞的細(xì)胞因子譜，結(jié)果表明，γδ T細(xì)胞分泌IL-4，IL-10及IL-22的

13、水平較低，主要以分泌IL-17和IFN-γ為主，其中感染后IL-17+γδ T細(xì)胞的比例明顯升高，48小時(shí)達(dá)到頂峰，且一直維持較高水平(P<0.01)。而IFN-γ+γδ T細(xì)胞感染前后無(wú)顯著變化。并且，IL-17+γδ T細(xì)胞是H.pylori感染早期主要的IL-17來(lái)源。結(jié)果提示，γδ T細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-17參與了H.pylori感染的免疫應(yīng)答。
　　 1.6 H.pylori感染過(guò)程中γδ T細(xì)胞分泌IL-17依賴于

14、IL-23的表達(dá)。
　　 2.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中的具體作用
　　 2.1 H.pylori分別感染野生型及γδ T細(xì)胞敲除小鼠，結(jié)果顯示敲除小鼠胃粘膜H。pylori定植量及組織炎癥程度均顯著高于野生型小鼠(P<0.05)。提示γδ T細(xì)胞在H。pylori可能發(fā)揮免疫保護(hù)性作用。
　　 2.2我們采用體外擴(kuò)增的γδ T細(xì)胞過(guò)繼免疫TCR-δ-/-小鼠后再感染H.pylori，檢測(cè)細(xì)菌定植量和胃

15、組織炎癥的變化。與HBSS處理組相比，過(guò)繼免疫組H.pylori感染后胃粘膜H.pylori定植量及組織炎癥程度均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了γδT細(xì)胞在抵御H.pylori感染定植中的保護(hù)性作用。
　　 3.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中的作用機(jī)制研究
　　 3.1采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了H.pylori感染后野生型小鼠與敲除小鼠的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(Th細(xì)胞)的變化。結(jié)果顯示，敲除γδ T細(xì)胞后，Th1

16、7和Th22細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)，而Th1和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答則減弱。胃粘膜組織real-time PCR結(jié)果也顯示，敲除小鼠感染H.pylori后，IL-17水平在感染早期較野生型小鼠低，而在感染后期(28d)，其水平則顯著升高。感染后期的IFN-γ表達(dá)則明顯減弱。提示，γδ T細(xì)胞可能通過(guò)影響后續(xù)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與了H.pylori感染的免疫保護(hù)效應(yīng)。
　　 3.2感染早期γδ T細(xì)胞敲除小鼠胃粘膜中性粒細(xì)胞趨化相關(guān)

17、的細(xì)胞因子及趨化因子(CXCL1，CXCL2，IL-6，GM-CSE，TNF-α)水平降低。提示γδ T細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-17誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集控制H.pylori早期感染的增殖擴(kuò)散。
　　 3.3分析了H.pylori感染后野生型小鼠與敲除小鼠血清及胃粘膜的IgG和IgA抗體水平。結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞敲除后，血清IgG水平無(wú)明顯改變(P>0.05)，而粘膜局部的IgA水平則明顯減低(P<0.05)。說(shuō)明γδ T細(xì)胞在粘

18、膜局部抗體的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮一定作用。
　　 3.4γδ T細(xì)胞缺失后，感染小鼠胃組織中趨化因子CCL2，CCL25及CXCL1的表達(dá)與野生型小鼠相比顯著升高(P<0.05)，而CCL28的表達(dá)則明顯減低(P<0.05)。其他趨化因子CCL5，CCL20和CXCL2表達(dá)并無(wú)明顯改變(P>0.05)。
　　 3.5敲除γδ T細(xì)胞后，H.pylori感染小鼠胃組織MMP-9的表達(dá)顯著升高，MMP-7的表達(dá)則明顯減低(P<0.

19、05)，其他MMP-2，MMP-3和MMP-13的表達(dá)沒有顯著變化。
　　 以上結(jié)果提示我們?chǔ)忙?T細(xì)胞可能通過(guò)影響部分MMP及趨化因子的表達(dá)參與H。pylori感染后的免疫調(diào)控及炎癥反應(yīng)。
　　 4.H.pylori感染患者外周血中γδ T細(xì)胞分析
　　 γδ T細(xì)胞在H.pylori感染和未感染患者外周血中的比例并無(wú)明顯變化(P>0.05)。然而，相對(duì)于H.pylori陰性患者，H.pylori感染患者外周血

20、中產(chǎn)IL-17和IL-22的γδ T細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。并且外周血中存在IFN-γ，IL-17+或IL-22+共表達(dá)的γδ T細(xì)胞。
　　 主要結(jié)論:
　　 1.H.pylori感染后可以迅速激活誘導(dǎo)γδ T細(xì)胞應(yīng)答。PP結(jié)及iIEL是H.pylori感染后較早應(yīng)答的免疫場(chǎng)所。應(yīng)答的γδ T細(xì)胞主要是Vγ4亞型，并且以分泌IL-17的γδT細(xì)胞為主，這類IL-17+γ6 T細(xì)胞主要依賴于IL-23的表達(dá)。<

21、br>　　 2.γδ T細(xì)胞在H.pylori感染中主要發(fā)揮免疫保護(hù)性作用。
　　 3.早期應(yīng)答的γδ T細(xì)胞可能通過(guò)影響H.pylori特異的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(細(xì)胞免疫和體液免疫)，調(diào)節(jié)部分MMP以及趨化因子的表達(dá)參與了H.pylori的定植量及炎性反應(yīng)強(qiáng)度的控制。
　　 4.H.pylori感染患者外周血γδ T細(xì)胞比例無(wú)顯著變化，但I(xiàn)L-17+γδ T細(xì)胞明顯升高，提示γδ T細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-17參與了機(jī)體的

22、免疫應(yīng)答。
　　 研究意義:
　　 H.pylori感染的免疫機(jī)制研究以前主要集中在慢性持續(xù)性感染誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，而感染初期的固有免疫系統(tǒng)的作用并不完全清楚。γδ T細(xì)胞作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要橋梁，在感染性疾病中發(fā)揮重要作用。深入了解這群細(xì)胞在H.pylori感染中的作用及免疫調(diào)控機(jī)制有助于全面闡述H.pylori感染慢性持續(xù)化致病機(jī)制，為采取正確的免疫調(diào)控方式逆轉(zhuǎn)其慢性持續(xù)化進(jìn)程提供新的線索。