食管早期癌變過程中PIK3CA基因的擴增及其意義.pdf

1、背景和目的：
　　食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，最新全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2012年全球食管癌新發(fā)病例45.58萬，死亡病例40多萬。世界上70％的食管癌病例發(fā)生在我國，其中90％以上是食管鱗狀細胞癌，該腫瘤導致的死亡在我國排名第四位。食管癌早期癥狀不明顯，大部分患者就診時已到中、晚期，雖然手術模式不斷推陳致新，但是中晚期食管癌患者的5年生存率僅為10%左右。食管癌變是一個長期的、多因素、多基因的復雜演變過程，目前關于食管鱗

2、狀細胞癌分子機制研究很多，如果在食管早期癌變過程中找到一種或幾種特異的分子標記物，將有利于食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。PTEN/PIK3CA/AKT通路調控人類多個腫瘤的發(fā)生，其通路中關鍵的基因PIK3CA調控細胞的增殖、細胞存活、遷移，凋亡以及惡性轉化，在食管腫瘤里面已經廣泛研究。但是目前缺乏食管早期上皮癌變過程中PIK3CA基因異常的研究。
　　本研究擬通過對食管早期上皮癌變過程中PIK3CA相對拷貝數(shù)和其蛋白表達水平的研究

3、，以期能進一步發(fā)現(xiàn)用于早期食管癌前病變監(jiān)控和食管癌早期診斷的分子生物學指標。
　　材料與方法：
　　材料：
　　1、收集2013-2014年汕頭大學醫(yī)學院病理科59例術前未經放、化療食管癌患者的手術標本，即42例完全配對新鮮標本進行熒光定量PCR，包括癌組織(Carcinoma，CA)、異型增生(Dysplasia，D)，單純性增生(Hyperplasia，H)以及食管遠端切緣黏膜下的肌肉組織(Muscle，M)作為對

4、照；和43例不完全配對石蠟切片（其中與新鮮組織重復取樣有26例配對標本），CA（38例）、D(25例)、H(34例)、正常黏膜(Normal，N)(30例)，標本均在癌、癌旁黏膜(距癌2 cm以內)及遠端切緣黏膜(距癌5 cm外)取材，分別標記為CA、P、Y。
　　2、正常食管黏膜上皮永生化細胞系NE3和食管癌細胞系EC109均由香港大學曹世華教授惠贈。
　　方法：
　　1、HE染色：觀察食管癌以及食管癌旁黏膜及遠端切

5、緣黏膜的組織學類型。
　　2、Quantitative PCR(q-PCR)：檢測顯微切割新鮮食管癌的M,H,D和CA中PIK3CA基因的擴增情況；檢測NE3和EC109中PIK3CA基因擴增情況。
　　3、免疫組織化學染色：采用Envision Labelled Peroxidase System(ELPS)二步法檢測石蠟組織切片中食管癌的N，H，D和CA中PIK3CA蛋白的表達情況；采用免疫熒光驗證PIK3CA蛋白表達。

6、
　　4、免疫印跡實驗(Western blot,WB)：檢測新鮮食管癌的CA,P和N中PIK3CA蛋白的表達情況。
　　5、圖像采集：使用OLYMPUS BX43全能顯微鏡和OLYMPUS DP21圖像采集系統(tǒng)對染色結果進行分析。
　　6、統(tǒng)計方法：應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對統(tǒng)計結果進行分析，采用Wilcoxon符號秩檢驗、卡方檢驗和Spearman相關分析。P值<0.05有統(tǒng)計學意義，P值<0.01有顯著統(tǒng)計學

7、意義。
　　結果：
　　1、q-PCR發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因相對拷貝數(shù)從正常肌肉組織到食管上皮早期癌變的單純性增生，異型增生，浸潤癌組織中呈逐漸增高趨勢(rs=0.477，P<0.01)。
　　2、PIK3CA蛋白表達水平從食管癌的正常黏膜，異型增生到浸潤癌組織中逐漸增高(P<0.01)。
　　3、癌細胞系比食管上皮永生化細胞系中的PIK3CA基因相對拷貝數(shù)有明顯增加。
　　結論：
　　1、PIK3C