PIK3CA基因在胃癌遷移和侵襲過(guò)程中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤最重要的惡性特征，也是導(dǎo)致胃癌患者死亡的最主要原因，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確。PIK3CA基因是位于3q26.3的癌基因，目前普遍認(rèn)為PIK3CA的突變?cè)诮Y(jié)腸癌、腦癌、乳腺癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但在胃癌細(xì)胞中，PIK3CA基因的突變頻率為4.3-16％，且PIK3CA基因的突變與胃癌的臨床病理特征無(wú)關(guān)，提示PIK3CA基因突變?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用不明顯。文獻(xiàn)報(bào)道：PIK3CA基因

2、擴(kuò)增可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，那么，PIK3CA基因擴(kuò)增引起的異常表達(dá)是否參與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為是一個(gè)值得探討的問(wèn)題，且未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本課題擬觀察PIK3CA在胃癌細(xì)胞系及胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系；隨后化學(xué)合成PIK3CA-siRNA并分別轉(zhuǎn)染PIK3CA突變和野生型胃癌細(xì)胞，分析其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲的影響及其作用機(jī)制；并用PIK3CA/mTOR雙重抑制劑PI-103處理胃癌

3、細(xì)胞，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用；最后通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶向PIK3CA基因的miRNAs，分析這些候選miRNAs在胃癌細(xì)胞及血清中的表達(dá)情況。以揭示PIK3CA基因在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，為胃癌轉(zhuǎn)移的早期診斷及靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用半定量RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)3種不同分化胃癌細(xì)胞HGC-27、BGC-823和SGC-7901中PIK3CA mRNA及蛋白表達(dá)水

4、平。通過(guò)Transwell侵襲小室法檢測(cè)其侵襲力，分析PIK3CA基因表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化和侵襲力的關(guān)系。
　　2.采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PIK3CA基因在正常胃黏膜組織、原發(fā)胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過(guò)Western blot檢測(cè)各組織中Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平，分析PIK3CA基因表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路激活的關(guān)系。
　　3.化學(xué)合成PIK3CA-siR

5、NA并分別轉(zhuǎn)染PIK3CA突變和野生型胃癌細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot分析PIK3CA基因的表達(dá)水平，觀察PIK3CA基因沉寂后胃癌細(xì)胞增殖，遷移及侵襲的變化，并檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)變化，初步探討PIK3CA基因表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其相關(guān)信號(hào)途徑。
　　4.用不同濃度PI-103（0.1、0.5、1、1.5、2.5μM）處理胃癌細(xì)胞BGC-823，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液。通過(guò)MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwe

6、ll檢測(cè)PI-103對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌遷移和侵襲過(guò)程中的作用。
　　5.通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶向PIK3CA基因的miRNAs，結(jié)合既往文獻(xiàn)初步確定靶向PIK3CA的候選miRNAs，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)這些miRNAs在胃癌細(xì)胞及血清中的表達(dá)情況，預(yù)測(cè)靶向PIK3CA基因的miRNA在胃癌遷移和侵襲過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.與低分化BGC-823

7、細(xì)胞和中等分化的SGC-7901細(xì)胞比較，未分化HGC-27細(xì)胞中PIK3CA mRNA和蛋白表達(dá)水平更高, PIK3CA mRNA和蛋白表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度成正相關(guān)。未分化HGC-27細(xì)胞遷移至Transwell下室的細(xì)胞更多( p<0.05)。其中，HGC-27細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為45.24±3.16,低分化BGC-823細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為22.28±1.65及中等分化SGC-7901細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為14.42±1.02。
　

8、　2.與正常胃黏膜組織比較，PIK3CA mRNA和蛋白表達(dá)水平在原發(fā)胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌組織中均顯著上升，轉(zhuǎn)移胃癌組織中PIK3CA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于原發(fā)胃癌組織。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中PIK3CA mRNA表達(dá)水平最高，分別為正常胃黏膜組織及原發(fā)胃癌組織的5倍和2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，但與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果表明，PIK3CA蛋白在原發(fā)胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)

9、處轉(zhuǎn)移胃癌組織中陽(yáng)性率分別為35%，67%和61%。與原發(fā)胃癌組織比較，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌組織中PIK3CA蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(35%vs67%, p=0.015<0.05;35% vs61%, p=0.044<0.05)。隨著PIK3CA表達(dá)水平的上調(diào)，磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平顯著增高，但總Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。此外，胃癌組織中PIK3CA蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(p<0.05)，而與患者的性別、年齡、臨床分期等因

10、素?zé)o關(guān)(p>0.05)。
　　3.靶向PIK3CA的siRNA能有效抑制內(nèi)源性PIK3CA mRNA及蛋白的表達(dá)，下調(diào)p-Akt的表達(dá)（p<0.05)，抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲(p<0.01)。PIK3CA突變的HGC-27細(xì)胞比PIK3CA野生型的BGC-823細(xì)胞侵襲力更強(qiáng)，靶向PIK3CA的siRNA對(duì)PIK3CA突變的HGC-27細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)比PIK3CA野生型的BGC-823細(xì)胞更強(qiáng)。
　　4. PI-

11、103能有效抑制胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞的增殖，這種效應(yīng)具有濃度依賴性；與對(duì)照細(xì)胞比較，用PI-103處理后的BGC-823細(xì)胞劃痕愈合慢，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少（p<0.05）。
　　5. miR-203在SGC-7901及MGC-803胃癌細(xì)胞系中表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但胃癌患者血清中miR-203表達(dá)明顯低于健康人血清（p<0.05）。 miR-506在胃癌SGC-7901細(xì)胞系和MGC-803細(xì)胞系、胃癌患者和健康人血清中表

12、達(dá)水平均無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. PIK3CA mRNA和蛋白在多種胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中高表達(dá)；PIK3CA的表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度成負(fù)相關(guān)，與胃癌細(xì)胞侵襲力成正相關(guān)；PIK3CA過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲，PIK3CA高表達(dá)可作為預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　2. PIK3CA特異性siRNA能有效降低胃癌HGC-27細(xì)胞和胃癌BGC-823細(xì)胞PIK3CA的表達(dá)，顯著抑制胃癌HGC-27細(xì)胞和胃癌BG