鼻咽癌中PIK3CA基因的突變.pdf

1、1．研究背景與目的 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)南方廣東人群中最常見(jiàn)的一種惡性上皮腫瘤，發(fā)病率居世界首位，達(dá)30～50／10萬(wàn)，但在世界大多數(shù)地區(qū)比較少見(jiàn)。鼻咽癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，一般認(rèn)為與遺傳因素、EB病毒感染和環(huán)境理化因子有關(guān)，但具體的分子機(jī)理仍不清楚。鼻咽癌同時(shí)又具有明顯的地域性、種族性和家族聚集性，這些事實(shí)提示著遺傳易感性在部分人群中的存在。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展

2、與染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)，癌基因的激活和抑癌基因的失活是大多數(shù)腫瘤發(fā)生的主要機(jī)理，分析腫瘤DNA的擴(kuò)增或丟失為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理提供有意義的線(xiàn)索，也為篩選腫瘤易感基因(抑癌基因和癌基因)提供定位信息。 有報(bào)道顯示NPC病人的3號(hào)染色體長(zhǎng)臂經(jīng)常出現(xiàn)畸變，因而懷疑這一區(qū)域可能與鼻咽癌的病因?qū)W有關(guān)。Mitelman F等首先確認(rèn)2例鼻咽癌組織存在3q+；waghray等也在鼻咽癌細(xì)胞株中檢測(cè)到3q+的標(biāo)記染色體；周宏遠(yuǎn)對(duì)41

3、例活檢組織的分析也發(fā)現(xiàn)NPC中染色體異常以易位形成的巨大亞中著絲粒染色體t(1；3)為主。在5個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系中非隨機(jī)性染色體畸變以1、2、6、7、9和15號(hào)染色體易位常見(jiàn)，其中3號(hào)染色體易位最常見(jiàn)，表現(xiàn)為3q+。 盡管3q+在鼻咽癌細(xì)胞及活檢組織中表現(xiàn)出較大的異質(zhì)性，其斷裂和增加的部分在不同細(xì)胞系及組織中報(bào)道有差異，上述結(jié)果仍舊可以提示3q在鼻咽癌中具有特異性，可能與鼻咽癌的病因?qū)W有關(guān)。 比較基因組雜交(CGH)的結(jié)果則表明

4、NPC的3q26附近是常見(jiàn)的高頻擴(kuò)增區(qū)域之一，有學(xué)者則發(fā)現(xiàn)位于這一區(qū)域的磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α基因PIK3CA gene)在鼻咽癌中出現(xiàn)高拷貝擴(kuò)增。PIK3CA基因是磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinases，P13Ks)信號(hào)通路的關(guān)鍵成員，既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因在多種腫瘤中存在擴(kuò)增，并推測(cè)它在這些腫瘤中可能扮演癌基因的角色。最近的研究又發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因在多種腫瘤中存在點(diǎn)突變，突變率

5、達(dá)到20％～40％。這些突變并非隨機(jī)分布，其第9外顯子和第20外顯子是突變熱點(diǎn)區(qū)，分別對(duì)應(yīng)著該蛋白的螺旋區(qū)和激酶區(qū)。進(jìn)一步的體外試驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)最高頻的突變E545K和H1047R都使PIK3CA的催化活性增高，增強(qiáng)了PI3K的活性和磷酸化激活A(yù)kt的作用，這些研究支持PIK3CA基因在多種腫瘤中扮演癌基因的角色。 本研究旨在通過(guò)對(duì)PIK3CA在鼻咽癌中的突變檢測(cè)，探討PIK3CA基因與鼻咽癌發(fā)病的關(guān)系。 2．研究方法與

6、結(jié)果 考慮到NPC活檢標(biāo)本中幾乎總雜有比例不等的正常組織，其比例有時(shí)甚至超過(guò)癌組織，這種正常組織的“污染”即使在采用了顯微切割技術(shù)后也很難完全避免。為盡可能避免這種“污染”所導(dǎo)致的突變漏檢(假陰性)，我們采用了克隆測(cè)序技術(shù)。 本研究針對(duì)PIK3CA基因的兩個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域外顯子9和外顯子20進(jìn)行了突變篩查。對(duì)46例散發(fā)性NPC組織標(biāo)本DNA，采用PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序；對(duì)3個(gè)NPC細(xì)胞系(CNE1，CNE2，SUNE1)DNA

7、、以及上述46例NPC病人血DNA，則將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。 結(jié)果：1.通過(guò)克隆測(cè)序分析，在46例NPC標(biāo)本中，1例外顯子9發(fā)現(xiàn)1563T→G錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸521Asn→Lys；在另1例外顯子9發(fā)現(xiàn)1646A→G錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸549Asp→Gly；上述兩種錯(cuò)義突變均未見(jiàn)報(bào)道。在18例檢出1634A→C、del 1658G和1659T→C，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST，發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因第9外顯子區(qū)與22

8、q11.2的Cat Eye Syndrome region高度同源，兩者的同源性達(dá)97％。含有上述“復(fù)合突變”的序列與Cat Eye Syndrome region上的序列完全一致，推測(cè)該“復(fù)合突變”為22號(hào)染色體上同源序列，而非PIK3CA第9外顯子的突變；在外顯子20未發(fā)現(xiàn)突變。2.通過(guò)PCR—直接測(cè)序，在3個(gè)NPC細(xì)胞系以及46例NPC病人血DNA的外顯子9和外顯子20均未發(fā)現(xiàn)突變。 3.結(jié)論 PIK3CA基因在鼻