激活素A在糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 隨著世界范圍內(nèi)糖尿病患者的迅速增加，糖尿病并發(fā)癥對患者生存質(zhì)量和死亡率的影響也越來越重要。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因。DN過去一直被認(rèn)為是一種腎小球疾病，而新近的研究表明，小管損傷和進(jìn)行性間質(zhì)纖維化與DN的預(yù)后關(guān)系更為密切。為此，研究DN小管間質(zhì)病變發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，

2、對于尋找更加有效的治療措施具有重要意義。 DN小管間質(zhì)病變的核心是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在損傷區(qū)的過量堆積。研究表明，由小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽性的肌成纖維母細(xì)胞是ECM的主要來源。多種細(xì)胞因子和生長因子參與了ECM的生成和降解，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth fa

3、ctor-beta， TGF-β）超家族成員發(fā)揮了重要作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和和分子生物學(xué)差異，TGF-β超家族可以細(xì)分為三個(gè)主要家族：TGF-β、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和激活素（activin，ACT）。研究表明，在實(shí)驗(yàn)性DN早期，TGF-β在小管上皮表達(dá)即明顯上調(diào)，并可促進(jìn)小管上皮細(xì)胞向肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。體外培養(yǎng)的小管上皮細(xì)胞，高糖和糖基化終末期產(chǎn)物（advanced glycatio

4、n end products，AGEs）均可通過TGF-β依賴的方式促進(jìn)ECM成分的產(chǎn)生。BMP-7與TGF-β作用正好相反，內(nèi)源性BMP-7可阻止小管上皮細(xì)胞ECM的產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)性DN模型中，BMP-7及其受體表達(dá)均明顯下調(diào)。 ACT最早是在性腺發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，因特異性促進(jìn)垂體細(xì)胞合成及分泌卵泡刺激素（FSH）而得名。ACT是由兩個(gè)β亞單位借二硫鍵構(gòu)成的二聚體蛋白，按照β亞基構(gòu)成的不同，ACT分為三種形式：ACTA（βAβA）

5、、ACTB（βBβB）、ACT AB（βAβB），目前研究最多的是ACTA。類似于TGF-β超家族其它成員，ACT A主要通過Smad信號(hào)途徑介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)。卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)S）是由性腺分泌的單鏈多肽，可抑制垂體FSH的分泌。FS與ACT有很強(qiáng)的親和力，并阻斷其生物學(xué)效應(yīng)；二者共同構(gòu)成一個(gè)維持組織器官正常生長和代謝的自動(dòng)平衡系統(tǒng)。目前對于ACT A在腎小管間質(zhì)病變中的作用機(jī)制研究甚少，ACT與DN小管間質(zhì)纖維化之間

6、的潛在聯(lián)系尚待進(jìn)一步研究。 目的: 本研究通過體內(nèi)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型及體外高糖刺激的人近端腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2），探討ACT A/Smad信號(hào)在糖尿病腎臟的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA和ECM成分纖維連接蛋白（FN）變化的關(guān)系。 方法: 1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成糖尿病組（DM）和對照組（NC）。DM組在禁食12小時(shí)后一次性腹腔注射STZ（60mg

7、/kg），NC組給予相同劑量的溶媒。給藥72h后尾靜脈采血測隨機(jī)血糖（BG）>16．7mmol/L為糖尿病大鼠。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。各組分別于造模后4、8、12、16周處死大鼠6只。處死前1天，大鼠稱重后單只置于代謝籠中，準(zhǔn)確收集24h尿液。腹主動(dòng)脈取血后分離左腎，部分腎組織固定于10％多聚甲醛供病理及免疫組化檢查，另一部分置液氮待做PCR檢測。腎臟肥大指數(shù)用左腎重/體重（KW/BW）表示；放免法測定尿白蛋白排泄率（AER）

8、； BG、血肌酐（Scr）及尿肌酐（Ucr）用HITACHI-7150自動(dòng)生化分析儀檢測，肌酐清除率（Ccr）按公式：Ucr×每分鐘尿量（ml）/Scr計(jì)算，并以體重校正。光鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化檢測腎組織中ACTβA、FS、P-Smad2/3、α-SMA和FN蛋白表達(dá)； real time-PCR檢測腎組織中ACT pA、FS、α-SMA和FNmRNA的表達(dá)。 2．細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞生長于含10％胎牛血

9、清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞生長同步化24h，然后將細(xì)胞分為以下5組：正常對照組（NG，5．5mmol/L葡萄糖）、甘露醇對照組（MG，5．5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇）、高糖組（HG，25mmol/L葡萄糖）、HG+FS100組（25mmol/L葡萄糖+100ng/mlFS）、HG+FS5

10、00組（25mmol/L葡萄糖+500ng/mlFS）。12、24、48h后收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液。Western blot檢測各組細(xì)胞ACTβA和P-Smad2/3的表達(dá)；ELISA檢測各組細(xì)胞上清液TGF-β、α-SMA和FN的含量。 結(jié)果: 1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1．1一般生化指標(biāo)的變化 在各時(shí)間點(diǎn)，DM組大鼠血糖明顯高于NC組。DM組大鼠KW/BW、AER及Ccr從第8周開始升高，并呈逐漸增高趨勢，與N

11、C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）； DM組內(nèi)16周末與8周末比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P<0．01）。 1．2腎小管間質(zhì)組織病理改變 PAS染色結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)NC組腎小管結(jié)構(gòu)正常，沒有間質(zhì)水腫和纖維化。DM組大鼠自實(shí)驗(yàn)第8周起可見部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎小管肥大、擴(kuò)張和萎縮，腎間質(zhì)可見纖維化，隨時(shí)間延長病變逐漸加重，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)逐漸增加。 1．3免疫組化檢測腎小管間質(zhì)ACTβA、FS、P-Sma

12、d2/3、α-SMA和FN的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，NC組大鼠在腎小球、腎小管及間質(zhì)均未檢測到ACTβA的表達(dá)；DM組大鼠腎小管上皮細(xì)胞ACTβA陽性表達(dá)自第4周起逐漸增加，并于12周時(shí)達(dá)峰值。與之相反，F(xiàn)S在NC組大鼠腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)，在DM組其表達(dá)從第4周開始逐漸下降。P-Smad2/3和FN在NC組腎小管和間質(zhì)有輕度表達(dá)，而在DM組大鼠從第8周起表達(dá)量逐漸增加，并一直持續(xù)到第16周。α-SMA在NC組僅表達(dá)于脈管系統(tǒng)

13、，DM組除血管壁外，從第8周開始，腎小管和腎間質(zhì)表達(dá)亦明顯增加。 1．4腎組織ACTβA、FS、α-SMA和FNmRNA的表達(dá) ACTβA mRNA在NC組只有極微量表達(dá)，而DM組大鼠腎組織ACTβA mRNA從第4周起即開始增加（NC組的3．3倍），于12周時(shí)達(dá)峰值（NC組的7．7倍），16周時(shí)表達(dá)量略有下降，但仍明顯高于NC組（P<0．01）；與之相反，F(xiàn)S在NC組大量表達(dá)，而DM組表達(dá)逐漸減少，實(shí)驗(yàn)第4周和12周

14、時(shí)與NC組相比分別下降了32．5％和52．9％。與NC組相比，4周時(shí)DM組腎組織α-SMA和FN mRNA表達(dá)無明顯改變，但從第8周起逐漸增加，并于第16周時(shí)達(dá)峰值。 2．細(xì)胞培養(yǎng) 2．1 ACTβA和P-Smad2/3在HK-2細(xì)胞的表達(dá)及FS的干預(yù)作用 Western blot檢測結(jié)果顯示，ACTβA在NG組細(xì)胞有微量表達(dá)，而HG組ACTβA表達(dá)顯著增加，呈時(shí)間依賴性。與HG組相比，F(xiàn)S干預(yù)組ACTβA表達(dá)

15、顯著減少，呈劑量依賴性；高糖培養(yǎng)48h后，HG+FS500組ACTβA表達(dá)與NG組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。與NG組相比，P-Smad2/3在HG組培養(yǎng)24h后表達(dá)明顯增加；FS可抑制P-Smad2/3的高表達(dá)，高糖培養(yǎng)48h后，HG+FS100組和HG+FS500組與HG組相比，P-Smad2/3表達(dá)分別下降了26％和41％。MG組細(xì)胞中ACTβA和P-Smad2/3表達(dá)與NG組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。 2．

16、2 TGF-β、α-SMA和FN在HK-2細(xì)胞上清的表達(dá)及FS的干預(yù)作用 ELISA檢測結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組培養(yǎng)12h后TGF-β表達(dá)即顯著增加，呈時(shí)間依賴性，F(xiàn)S干預(yù)對高糖誘導(dǎo)的TGF-β高表達(dá)沒有影響。與NG組相比，HG組培養(yǎng)24h后α-SMA和FN表達(dá)顯著增高（P<0．01），F(xiàn)S對此有明顯抑制作用，呈劑量依賴性（P<0．01）。MG組TGF-β、α-SMA和FN的表達(dá)與NG組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。