白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的作用和機(jī)制研究.pdf

1、本研究以大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F)以及人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為體外研究對(duì)象，并利用了C57BL/Ksj/db/db-(db/db)小鼠為2型糖尿病動(dòng)物模型，分以下三部分對(duì)白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制進(jìn)行研究:(1)首先明確高糖誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化和腎小管上皮細(xì)胞EMT的作用機(jī)制;(2)其次探討白藜蘆醇是否能夠通過調(diào)控AMPK/NADPH信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化及腎小管

2、上皮細(xì)胞EMT;(3)最后通過觀察2型糖尿病動(dòng)物模型db/db小鼠予以白藜蘆醇干預(yù)后腎間質(zhì)纖維化情況以及對(duì)腎臟內(nèi)AMPK/NADPH信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探討了白藜蘆醇在抑制糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制。
　　主要研究結(jié)果和研究?jī)?nèi)容如下:
　　一、高糖可以通過活化NOX4促進(jìn)ROS生成，誘導(dǎo)腎成纖維細(xì)胞增殖與活化;
　　Western blot檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖(30 mmol/L)處理48 h后大鼠

3、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞NRK-49F肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和ECM的重要組分纖維粘連蛋白(Fibronectin)表達(dá)均明顯升高，這說明在高糖誘導(dǎo)下，靜止的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，分泌和合成ECM增多。同時(shí)，CCK-8檢測(cè)提示，高糖可以誘導(dǎo)NRK細(xì)胞增殖。
　　鑒于ROS在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的重要作用，我們用DCFH-DA法檢測(cè)高糖作用NRK細(xì)胞48 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可

4、以誘導(dǎo)NRK細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，而NADPH氧化酶抑制劑二苯基碘(DPI)(10μmol/L)可以明顯抑制高糖引起的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，這說明高糖誘導(dǎo)NRK細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源為NADPH氧化酶。接下來我們通過Western blot檢測(cè)NADPH氧化酶在NRK細(xì)胞中表達(dá)的主要活性亞基，并發(fā)現(xiàn)高糖可以引起NRK細(xì)胞NOX4的表達(dá)增加，而NOX1、NOX2的表達(dá)并無明顯變化。為了明確NOX4在高糖誘導(dǎo)NRK細(xì)胞增殖、活化中的

5、作用，我們用DPI預(yù)孵育細(xì)胞1h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況以及Western blot檢測(cè)細(xì)胞活化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DPI可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞增殖與活化，這說明高糖是通過促進(jìn)NOX4依賴的ROS產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與活化。
　　二、白藜蘆醇可以抑制高糖誘導(dǎo)NOX4來源的ROS生成及腎成纖維細(xì)胞的增殖與活化;
　　為了明確白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)NRK細(xì)胞增殖與活化的作用，我們用白藜蘆醇(5-20μmol/L)預(yù)孵育細(xì)胞

6、后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞増殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可以顯著誘導(dǎo)NRK細(xì)胞增殖，而白藜蘆醇劑量依賴性地抑制高糖引起的細(xì)胞增殖。同時(shí)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇(20μmol/L)抑制了高糖誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞活化。另外，與DPI類似，白藜蘆醇可以明顯抑制高糖引起的細(xì)胞內(nèi)NOX4表達(dá)增加和ROS產(chǎn)生增多，提示了白藜蘆醇可以通過抑制高糖誘導(dǎo)的NOX4依賴的ROS升高，從而抑制NRK細(xì)胞的增殖和活化。
　　三、白藜蘆醇通過激活A(yù)MPK

7、信號(hào)通路抑制NADPH氧化酶活化和ROS生成，從而進(jìn)一步抑制高糖誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞增殖與活化;
　　糖尿病中，NADPH氧化酶是AMPK信號(hào)分子潛在的下游靶點(diǎn)。我們用Western blot檢測(cè)p-AMPK的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，高糖可以抑制NRK細(xì)胞AMPK信號(hào)活性，而白藜蘆醇則上調(diào)高糖引起的AMPK信號(hào)活性降低。不僅如此，AMPK信號(hào)通路抑制劑CompoundC(10μmol/L)可以阻遏白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞增殖、活化以及NO

8、X4表達(dá)增加的抑制作用，進(jìn)一步證明了白藜蘆醇是通過調(diào)控AMPK/NADPH信號(hào)通路來抑制NRK細(xì)胞增殖與活化。
　　四、白藜蘆醇可以通過減少NADPH氧化酶來源的ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;
　　人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)在經(jīng)高糖誘導(dǎo)48 h后，部分細(xì)胞失去了正常的鵝卵石樣形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形。同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，高糖作用HK-2細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯

9、下降，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)明顯升高，而白藜蘆醇可以抑制上述細(xì)胞表型指標(biāo)的改變，這說明白藜蘆醇抑制了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT。此外，DCFH-DA檢測(cè)提示，與正常對(duì)照組相比，高糖可時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS增加。因腎臟ROS的主要來源為NADPH氧化酶，故我們用Westernblot法檢測(cè)NADPH氧化酶在HK-2細(xì)胞表達(dá)的主要亞基，發(fā)現(xiàn)高糖可以時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞NOX1、NOX4表達(dá)增加。然而，與DP

10、I類似，白藜蘆醇可以明顯抑制高糖引起的細(xì)胞內(nèi)NOX1和NOX4表達(dá)增加和ROS產(chǎn)生增多，這說明白藜蘆醇可以通過抑制高糖誘導(dǎo)的NOX1和NOX4依賴的ROS升高，從而抑制HK-2細(xì)胞EMT。
　　五、白藜蘆醇通過上調(diào)AMPK的信號(hào)活性抑制NADPH氧化酶的表達(dá)和ROS生成，從而抑制高糖引起的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化;
　　Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖可以顯著抑制HK-2細(xì)胞內(nèi)AMPK信號(hào)活性，而白藜蘆醇則可抑制高糖誘導(dǎo)的

11、AMPK信號(hào)活性降低，但加入AMPK抑制劑Compound C卻阻遏了白藜蘆醇抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT和NOX1、NOX4活化的作用，這說明白藜蘆醇是通過調(diào)控AMPK/NADPH信號(hào)通路來抑制HK-2細(xì)胞EMT。
　　六、外源性給予白藜蘆醇可以改善db/db小鼠腎間質(zhì)纖維化的程度，抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖與活化，白藜蘆醇對(duì)糖尿病腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用可能是通過調(diào)控AMPK/NOX4信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的;
　　為了明確在

12、糖尿病中白藜蘆醇對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用和體內(nèi)AMPK/NADPH信號(hào)通路的影響，我們以400 mg/kg/d白藜蘆醇喂食2型糖尿病模型db/db小鼠9周后，觀察小鼠生化指標(biāo)。與野生型小鼠組相比，db/db小鼠血糖、體重及24 h尿蛋白排出量明顯增加，而予以白藜蘆醇干預(yù)后的db/db小鼠24小時(shí)尿蛋白量較db/db小鼠明顯減少，但血糖和體重不受影響，這說明白藜蘆醇改善糖尿病腎病不依賴于其對(duì)血糖、體重的影響。并且，腎臟病理學(xué)染色PAS、MAS

13、SON染色證實(shí)了白藜蘆醇可以改善db/db小鼠腎間質(zhì)纖維化的病變程度。對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，db/db小鼠腎臟間質(zhì)中不僅正常成纖維細(xì)胞標(biāo)志物FSP-1以及ECM蛋白Fibronectin的表達(dá)顯著增高，α-SMA和PCNA免疫熒光雙染陽性的成纖維細(xì)胞亦增多，而白藜蘆醇可以抑制db/db小鼠腎臟內(nèi)的上述改變。以上實(shí)驗(yàn)均說明白藜蘆醇改善糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的作用可能與抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化有關(guān)。
　　為

14、了進(jìn)一步闡明白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎纖維化的作用機(jī)制，我們用Westernblot以及免疫組化檢測(cè)了小鼠腎臟內(nèi)p-AMPK、NOX1、NOX2和NOX4的表達(dá)。在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠腎臟內(nèi)p-AMPK表達(dá)明顯減少，而NOX4表達(dá)明顯增加，并非NOX1、NOX2，說明NOX4是導(dǎo)致糖尿病高糖狀態(tài)下腎臟ROS生成最主要的NADPH氧化酶。在給予白藜蘆醇干預(yù)后，db/db小鼠腎臟p-AMPK表達(dá)有所增加，而腎臟內(nèi)NOX4的表達(dá)則顯著

15、降低，提示白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK抑制NOX4的表達(dá)，從而改善了db/db小鼠的腎間質(zhì)纖維化。
　　綜上所述，我們的研究表明，高糖可以誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化以及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其機(jī)制可能與高糖抑制了腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)AMPK的信號(hào)活性，從而促進(jìn)了NADPH氧化酶來源的ROS增加，最終導(dǎo)致了腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化和腎小管上皮細(xì)胞EMT有關(guān)。白藜蘆醇則可以通過調(diào)控AMPK/NADPH信號(hào)通路抑制高