載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變抑制作用的實驗研究.pdf

1、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy, PVR)是嚴重的致盲性眼病之一，臨床上復雜難治。為增加姜黃素的生物利用度并減少玻璃體腔注藥所可能引起的并發(fā)癥，本課題將首先制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞并對其體外藥物動力學進行初步研究，進而將制備成的載有不同劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在兔眼鞏膜壁睫狀體平坦部對其與周圍組織的生物相容性及毒副作用及玻璃體內(nèi)的藥物動力學進行研究，最后通過玻璃體腔

2、注射自血制作PVR兔眼模型，觀察鞏膜睫狀體平坦部置入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對兔眼PVR模型的防治效果，從而全面評價其防治PVR的可行性問題，探討應用姜黃素防治PVR更佳的給藥方式。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞及其體外動力學研究
　　目的:制備一種可以嵌置在睫狀體扁平部鞏膜壁上，可以緩慢釋放姜黃素至玻璃體腔的生物可降解鞏膜塞形的藥物釋放系統(tǒng)并對其體外藥物動力學作一初步研究

3、。
　　方法:應用Octagon200振動篩粉器將聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)、姜黃素制成100um大小顆粒，將不同劑量的姜黃素與PLGA按1∶5均勻混合后置于鞏膜塞模具中壓制成鞏膜塞。再將模具連同其內(nèi)的鞏膜塞置于烤箱中，燒結(jié)溫度設(shè)置在55℃范圍，持續(xù)30分鐘。將制備好的載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞置入裝有1.5ml平衡鹽溶液的玻璃試管內(nèi)，37℃溫浴，每24小時收集BSS姜黃素洗

4、脫液。試管中則加入新鮮BSS1.5ml，如此循環(huán)重復14天。應用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測各時間點BSS洗脫液內(nèi)姜黃素藥物質(zhì)量濃度。
　　結(jié)果:制備成分別含有0.5mg、1.0mg、1.5mg三種劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞，直徑約1mm，長約5mm。體外動力學結(jié)果顯示以PLGA為載體物質(zhì)的姜黃素生物可降解鞏膜塞可持續(xù)釋放姜黃素。
　　結(jié)論:可以應用PLGA作為載體物質(zhì)與不同劑量的姜黃素混合制備生物可降解的鞏膜塞形藥物

5、釋放系統(tǒng)，體外動力學檢測其可穩(wěn)定釋放一定量的姜黃素14天，其中含有1.5mg、1.0mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞在BSS液中的質(zhì)量濃度可在一定的時間內(nèi)持續(xù)高于15ug/ml。
　　第二部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞的眼部組織相容性及毒性研究
　　目的:對載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入鞏膜壁后其對周邊眼部組織生物相容性及毒性問題進行研究以期對這種給藥方式在眼部應用的安全性問題進行評價。
　　方法:共44只實驗用兔，

6、其中32只實驗用兔隨機分為對照組，0.5mg組，1.0mg組及1.5mg組4組，每組8只。對照組為選取每只兔的右眼只做鞏膜穿刺而不植入鞏膜塞。其余三組則選取每只兔的右眼結(jié)膜下鞏膜壁嵌置載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞。其余12只兔隨機分成上述4組，每組3只，雙眼使用方法同上（本組供14d、28d、60d時摘取眼球使用）。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1、7、14、21、28d測量各實驗眼眼壓、應用裂隙燈觀察結(jié)膜反應、前房炎癥反應以及角膜透明性，間接

7、檢驗鏡觀察玻璃體視網(wǎng)膜情況，并在各檢查點對實驗眼進行暗適應ERG檢查。對在14d、28d、60d摘取的眼球行光鏡及電鏡組織學檢查。
　　結(jié)果:鞏膜塞植入后各檢查時間點，對照組與各劑量鞏膜塞組實驗眼眼壓各組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:應用PLGA作為藥物載體的姜黃素生物可降解鞏膜塞植入鞏膜穿刺口，鞏膜塞與穿刺口間密閉性好，無滲漏，無炎癥反應，對周邊組織無損傷，經(jīng)過1至2個月鞏膜塞自然降解，無需二次手術(shù)取出，可以作為姜黃素治

8、療PVR的新型給藥裝置。為更好的發(fā)揮姜黃素各種藥理活性提供了新的給藥形式。
　　第三部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞在兔眼玻璃體腔內(nèi)的藥物動力學研究
　　目的:探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入眼內(nèi)后玻璃體內(nèi)的藥物釋放特點，為臨床應用提供參考依據(jù)。
　　方法:將22只新西蘭白兔隨機分為標準組及質(zhì)控組各3只兔（6只眼）和實驗組16只兔。實驗組再隨機分為2組，分別為1.0mg、1.5mg組，每組8只兔。標準及質(zhì)控組動物

9、不行鞏膜壁鞏膜塞置入操作，只行玻璃體抽取，實驗組右眼于角膜緣后3mm鞏膜壁嵌入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞，分別于鞏膜壁置入鞏膜塞后1d、7d、14d、21d、28d抽取并制備玻璃體待檢樣品。應用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測玻璃體腔內(nèi)藥物質(zhì)量濃度。
　　結(jié)果:姜黃素與玻璃體內(nèi)源性物質(zhì)之間的色譜峰分離良好，姜黃素保留時間為4.3 min。提取回收率約90％，日內(nèi)、日間變異較小。
　　結(jié)論:載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在

10、鞏膜壁后可以持續(xù)釋放姜黃素至玻璃體腔持續(xù)至少4周以上，藥物濃度可持續(xù)穩(wěn)定在姜黃素抑制RPE細胞增殖的最佳有效濃度15ug/ml以上，可以作為姜黃素抑制PVR的新型給藥方法。
　　第四部分 兔眼增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型的建立及相關(guān)因子的測定
　　目的:在藥物防治PVR的研究過程中，選擇一種操作簡單、節(jié)約成本、成模率高的制作PVR模型的方法并應用抗體芯片方法檢測實驗眼玻璃體樣本中相關(guān)因子的表達。
　　方法:新西蘭白兔16

11、只，隨機分為對照組和模型組，每組8只，右眼為實驗眼。所有實驗兔眼在角膜緣后3mm處用鞏膜穿刺刀刺向玻璃體中心部，勿傷及晶狀體及周邊視網(wǎng)膜，用穿刺刀向兩側(cè)擴大切口，切口與角膜緣平行達4mm，用8-0可吸收線間斷縫合切口后以2ml注射器從穿刺口進針抽取0.2ml玻璃體。對照組注入0.2mlBSS液，模型組注入0.2ml自血。術(shù)后1、3、7、14、21和28d進行裂隙燈顯微鏡、間接眼底鏡等眼科檢查;眼科B超檢查玻璃體和視網(wǎng)膜情況。分別于操作后

12、1d、7d、14d、21d、28d采取玻璃體樣本，應用QAL-CYT-2芯片檢測各檢測點抽取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin、MIP-1β、NCAM-1、TNF-α等細胞因子的表達。
　　結(jié)果:對照組術(shù)后各時間點無PVR發(fā)生。實驗后各檢測點模型組與對照組均未檢測到MIP-1β的表達。
　　結(jié)論:兔眼距角鞏膜緣3mm處鞏膜穿刺抽取玻璃體聯(lián)合玻璃體腔注射自血建立PV

13、R模型的方法操作簡單，成模時間快，成模率高，可檢測到多種炎癥因子表達，可作為藥物防治PVR研究的實驗模型。
　　第五部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變及相關(guān)因子的抑制作用研究
　　目的:探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入鞏膜壁后對自血玻璃體腔注射制作的PVR病變程度及相關(guān)因子的抑制作用。
　　方法:選用新西蘭白兔30只，隨機分為模型組與治療組，每組各15只，右眼為實驗眼。模型組:玻璃體腔注射

14、自血;治療組:玻璃體腔注射自血+鞏膜壁嵌置載有1.5mg姜黃素生物可降解鞏膜塞。術(shù)后1d、3d、7d、14d、21d和28d使用裂隙燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體、前節(jié)炎癥反應情況;使用間接檢眼鏡和B超檢查玻璃體視網(wǎng)膜情況。PVR分級采用FastenbergPVR分級方法分級。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1d、7d、14d、21d、28d采取玻璃體樣本，應用QAL-CYT-2芯片檢測各檢測點采取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8

15、、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin、MIP-1β、NCAM-1、TNF-α等細胞因子的表達。
　　結(jié)果:各檢測時間點治療組PVR的發(fā)展程度及分級均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;抗體芯片技術(shù)檢測結(jié)果，各檢測時間點治療組IL-1α、IL-1β、IL-8、MMP-9、TNF、NCAM-1、leptin的表達均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。IL-17因子在14d時模型組為1.2±0.5pg/

16、ml，21d時模型組、治療組玻璃體中的表達分別為9.2±3.0pg/ml、6.2±2.1pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.148,P=0.004)，其余測試點模型組與治療組未檢測到該因子的表達;7d、14d模型組、治療組玻璃體中IL-21的表達分別為6.0±2.2、3.8±1.3 pg/ml;10.0±3.0、6.8±1.9pg/ml，組間有顯著性差異(t=3.169，P=0.004; t=3.490,P=0.002)，其余檢測點未

17、檢測到該因子的表達，各時間點模型組、治療組均未檢測到MIP-1β的表達。治療組熒光掃描圖顯示熒光亮度或面積均低于或小于模型組。
　　結(jié)論:載有1.5mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入自血玻璃體腔注射的實驗眼鞏膜壁后，可以通過抑制IL-1、IL-8、TNF、MMP-9等細胞因子的表達實現(xiàn)對兔眼PVR病變的抑制作用。
　　基于上述研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論:應用PLGA作為載體物質(zhì)制各載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞，HPLC檢測體外及