增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的玻璃體蛋白質(zhì)組及其分子標志物的研究.pdf

1、目的： 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy,PVR)是導致視網(wǎng)膜脫離手術失敗最主要的原因。本研究利用蛋白質(zhì)組學平臺，對原發(fā)性孔源性視網(wǎng)膜脫離伴PVR的玻璃體蛋白質(zhì)組進行分離和鑒定，建立PVR和正常眼玻璃體蛋白質(zhì)組圖譜，篩選能評估術前PVR嚴重程度和手術預后的血清分子標志物。 方法： (1)二維液相色譜聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜(two-dimensional-liquidchr

2、omatographycoupledbytandemmassspectrometry,2D-LC-MS/MS)分離和鑒定PVR玻璃體的蛋白質(zhì)組：收集PVRB、C、D級患者的玻璃體原液和術前血清，正常捐獻眼玻璃體和健康人的血清為對照組。將相同等級的輕度PVR(PVRB級)和嚴重PVR(PVRC、D級)以及捐獻眼玻璃體樣本等量混合，丙酮沉淀過夜。重溶后測蛋白質(zhì)濃度，加入胰酶，37℃酶解過夜。過陽離子交換柱后進行在線反向色譜，納噴霧質(zhì)譜鑒定，

3、MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索。 (2)雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry,MALDI-TOF-MS)對PVR與正常玻璃體的差異蛋白質(zhì)組研究：實驗樣本同(1)。將同一等級的玻璃體樣本等量混合，丙酮沉淀過夜

4、。再水化液重溶后，加至固相pH梯度凝膠電泳膠條(18cm，pH3-10)進行水化，等電聚焦，100V/30min，3500V/4h，8000V/4h。平衡后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，30mA/6h。銀染后圖像分析。差異明顯(至少2倍以上的吸光度OD)的蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)酶解，質(zhì)譜鑒定后MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索。 (3)激肽原1在PVR玻璃體和血清中的驗證：PVRB、C、D級和正常捐獻眼玻璃體樣本和相應的血清樣本同(1)。同時，收集PV

5、RA級的玻璃體和術前血清樣本以及PVR術后不同狀態(tài)的血清樣本，包括環(huán)扎術后未愈者和硅油眼。對玻璃體和相應的血清樣本分別進行激肽原1的免疫印記分析(westernblottinganalysis，WB)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。(4)類胰島素生長因子結合蛋白-6(insulin-likegrowthfactorbindingprotein，IGFBP-6)在PVR的玻璃

6、體和血清中的驗證：實驗樣本同(3)。應用WB和。ELISA對玻璃體和相應的血清樣本進行驗證。 結果： (1)在捐獻眼、輕度和嚴重PVR玻璃體中分別鑒定到129、97和137種蛋白質(zhì)。其中，35種為三者共有的蛋白質(zhì)，24種為PVR玻璃體特異蛋白質(zhì)。血漿中的高豐度蛋白質(zhì)，如絲氨酸蛋白酶抑制劑家族、補體成分等和一些細胞外蛋白質(zhì)在PVR玻璃體中明顯上調(diào)或增加；同時細胞骨架蛋白質(zhì)微管蛋白以及參與糖酵解的酶，如丙酮酸激酶和烯醇化酶等

7、在PVR中明顯下調(diào)。在PVR特異的蛋白質(zhì)中，激肽原1是鑒定到的肽段數(shù)較多大的相對高豐度蛋白質(zhì)；而IGFBP-6與增殖的信號轉(zhuǎn)導有關。 (2)捐獻眼、輕度PVR和嚴重PVR玻璃體2-DE圖譜分別分析到47、184和336個蛋白質(zhì)點，在13個明顯差異蛋白質(zhì)中成功的鑒定到7種蛋白質(zhì)。其中，烯醇酶2是捐獻眼特有的；甲狀腺激素結合蛋白單體和視黃醇結合蛋白(retinol-bindingprotein，RBP)單鏈是在嚴重PVR玻璃體中特異

8、的蛋白質(zhì)；前列腺素D合成酶和RBP3前體是捐獻眼和PVR眼玻璃體共有的蛋白質(zhì)，輕度PVR時明顯增加，嚴重PVR時下調(diào)。血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，隨PVR嚴重程度增加而明顯上調(diào)。 (3)WB顯示激肽原1在PVR患者玻璃體和血清中檢測到而在正常捐獻眼和正常人的血清中未測到，且在PVRC、D級中明顯高于PVRB級。激肽原1可以在所有的PVR患者玻璃體和血清樣本中檢測到(24/24，100％)。ELISA顯示嚴重PVR患者玻璃體和血清中激肽

9、原1明顯高于輕度PVR(P＜0.05)。PVR患者術后6個月血清中激肽原l明顯下降(P＜0.05)，仍高于正常對照組(P＜0.05)。但環(huán)扎術后未愈者血清中激肽原1明顯高于正常對照組和硅油眼(P＜0.01)，亦高于玻切術后6個月隨訪組(P＜0.05)。(4)WB顯示，IGFBP-6在PVR的玻璃體和血清中檢測到而在正常捐獻眼和正常人血清中未測到，且在PVRC、D級中明顯高于PVRB級。IGFBP-6可以在91.7％的PVR.患者玻璃體和

10、血清樣本中檢測到(除外2個PVRB樣本)。ELISA顯示嚴重PVR患者的玻璃體和血清中IGFBP-6明顯高于輕度PVR(P＜0.05)。PVR患者術后6個月血清中IGFBP-6的濃度明顯下降(P＜0.05)，與玻璃體術后硅油眼和正常對照組的血清中的濃度接近(P＞0.05)，但明顯低于環(huán)扎術后未愈組(P＜0.05)。 結論： (1)本研究提示PVR是一個復雜的病理過程，玻璃體發(fā)生一系列的變化，有大量的新生蛋白質(zhì)生成、血漿蛋

11、白質(zhì)的侵入以及正常玻璃體的蛋白質(zhì)降解，證實了PVR的病程中存在血-視網(wǎng)膜屏障的破壞、細胞骨架的重塑、細胞免疫反應參與以及玻璃體的能量代謝障礙。 (2)2D-LC-MS/MS和2-DE-MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)策略的聯(lián)合應用可以互為補充，能夠更完整的揭示差異蛋白質(zhì)組的研究。 (3)激肽原1和IGFBP-6是候選的PVR血清分子標志物，可用于PVR嚴重程度的臨床分級和預后評價指標，并為預防PVR的藥物開發(fā)提供了新的靶向