從T輔助細(xì)胞的分化探討膽堿能抗炎通路對(duì)類風(fēng)溫關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用機(jī)制.pdf

1、第一部分迷走神經(jīng)及乙酰膽堿受體激動(dòng)劑-煙堿對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠T輔助細(xì)胞分布的影響
　　目的:T輔助細(xì)胞(helper T cell，Th cell)在調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)炎癥反應(yīng)中起了非常關(guān)鍵的作用。膽堿能抗炎通路可抑制RA動(dòng)物模型-膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen inducedarthritis，CIA)小鼠的關(guān)節(jié)炎癥。本部分探討迷走神經(jīng)及乙酰膽堿受體激動(dòng)劑-煙堿對(duì)CIA小鼠

2、體內(nèi)T輔助細(xì)胞亞群分布的影響。
　　方法:40只DBA/1小鼠隨機(jī)分成4組:對(duì)照組:假手術(shù)+每天腹腔注射PBS一次;模型組:假手術(shù)+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型復(fù)制;迷走神經(jīng)切斷術(shù)組:迷走神經(jīng)切斷術(shù)+每天腹腔注射PBS一次+CIA模型復(fù)制;煙堿處理組:假手術(shù)+每天腹腔注射煙堿一次+CIA模型復(fù)制。迷走神經(jīng)切斷術(shù)組在關(guān)節(jié)炎復(fù)制前4天切斷小鼠左頸部迷走神經(jīng)，假手術(shù)僅暴露并不切除左側(cè)頸部迷走神經(jīng)。煙堿組在關(guān)節(jié)炎復(fù)制的前4天每天腹腔

3、注射煙堿(250μg/kg)。評(píng)估小鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)及關(guān)節(jié)組織病理炎癥程度。酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)小鼠外周血IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Th1、Th2及Th17細(xì)胞比例。Western-blot技術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Th1、Th2及Th17細(xì)胞對(duì)應(yīng)的專一性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3及RORγτ的表達(dá)水平。免疫組化法檢測(cè)小鼠關(guān)節(jié)滑膜中RORγτ的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:乙酰膽堿受體激動(dòng)劑煙堿顯著減輕CI

4、A小鼠關(guān)節(jié)炎癥。迷走神經(jīng)切斷組小鼠關(guān)節(jié)炎癥較CIA組加重，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CIA組比較，煙堿組外周血IL-17A水平降低，IL-4水平增高;煙堿組脾臟中CD4+IL-17A+T細(xì)胞比例降低，CD4+IL-4+T細(xì)胞比例升高;煙堿組脾臟中Th17細(xì)胞專一性轉(zhuǎn)錄因子RORγτ表達(dá)下調(diào)，Th2細(xì)胞專一性轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達(dá)上調(diào);煙堿組關(guān)節(jié)滑膜中RORγτ表達(dá)降低;煙堿組和CIA組外周血IFN-γ、脾臟CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比

5、例及T-bet表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:煙堿減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥;煙堿減少CIA小鼠外周血、脾臟及關(guān)節(jié)滑膜Th17細(xì)胞分布;增加外周血及脾臟中Th2細(xì)胞分布，但對(duì)外周血及脾臟中Th1細(xì)胞分布無(wú)影響。
　　第二部分乙酰膽堿受體激動(dòng)劑對(duì)RA患者Th17細(xì)胞分化的影響及MEK-ERK1/2通路在其中的作用
　　目的:Th17細(xì)胞亞群的分布異常及其細(xì)胞效應(yīng)與RA炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本部分探討乙酰膽堿受體激動(dòng)劑煙堿和

6、GTS-21對(duì)RA患者Th17細(xì)胞分化的影響。
　　方法:分離RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，加入不同濃度煙堿及GTS-21培養(yǎng)，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A水平;用磁珠分選法從RA患者外周血PBMCs中分離得到CD4+T細(xì)胞，在Th17極化培養(yǎng)體系中加入煙堿或GTS-21，或α7煙堿型乙酰膽堿(nicotinic acetylcholine，n

7、Ach)受體阻斷劑α銀環(huán)蛇毒預(yù)刺激后再加入煙堿或GTS-21處理，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞比例，Western-blot法檢測(cè)RORc表達(dá);CD4+T細(xì)胞經(jīng)Th17分化培養(yǎng)72小時(shí)后，予煙堿，或MEK1/2抑制劑U0126預(yù)刺激后再加煙堿處理，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A水平，Western-blot法檢測(cè)ERK1/2表達(dá)。
　　結(jié)果:不同濃度煙堿及GTS-21均可降低RA PB

8、MCs培養(yǎng)上清中IL-17A水平。煙堿及GTS-21可減少Th17細(xì)胞分化過(guò)程中CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞比例，減少培養(yǎng)上清中IL-17A水平及胞內(nèi)RORc的表達(dá)，而α銀環(huán)蛇毒可逆轉(zhuǎn)煙堿及GTS-21對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制作用。煙堿可促進(jìn)Th17細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化，而U0126可阻斷煙堿對(duì)ERK1/2的磷酸化。
　　結(jié)論:煙堿及GTS-21通過(guò)作用于α7nAch受體抑制RA患者CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，

9、煙堿對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制作用與激活MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。
　　第三部分乙酰膽堿受體激動(dòng)劑對(duì)RA患者Th1、Th2細(xì)胞分化的影響
　　目的:在RA中，Th2細(xì)胞比例減少，Th1細(xì)胞比例增多，Th1/Th2比例失衡促進(jìn)了RA關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展。本部分探討乙酰膽堿受體激動(dòng)劑煙堿和GTS-21對(duì)RA患者Th1和Th2細(xì)胞分化的影響。
　　方法:分離RA患者外周血PBMCs，加入不同濃度煙堿及GTS-21培

10、養(yǎng)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平;用磁珠分選法從RA患者外周血PBMCs中分離得到CD4+T細(xì)胞，分別在Th1、Th2分化培養(yǎng)體系中加入煙堿或GTS-21，或乙酰膽堿受體阻斷劑α銀環(huán)蛇毒預(yù)刺激后再加入煙堿或GTS-21處理，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞比例，Western-blot法檢測(cè)T-bet和GATA3表達(dá)。
　　結(jié)果:GTS-21可降低RA PBMC

11、s培養(yǎng)上清中IFN-γ水平。GTS-21可減少Th1細(xì)胞分化過(guò)程中CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞比例，減少培養(yǎng)上清中IFN-γ水平及胞內(nèi)T-bet的表達(dá)，銀環(huán)蛇毒可逆轉(zhuǎn)GTS-21對(duì)Th1細(xì)胞分化的抑制作用。但煙堿對(duì)CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞比例、培養(yǎng)上清中IFN-γ水平及胞內(nèi)T-bet表達(dá)無(wú)影響。煙堿和GTS-21可提高PBMCs培養(yǎng)上清中IL-4水平，煙堿及GTS-21可增加Th2細(xì)胞分化過(guò)程中CD3+CD8-IL-4+