細(xì)胞外HSP70對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗炎作用及機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病。其病理特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜面的炎癥及滑膜組織的增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔的損傷和關(guān)節(jié)的破壞。盡管RA的發(fā)病機(jī)制迄今仍未完全闡明，但細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA的滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞中起到重要作用，是使RA病變持續(xù)存在、遷延進(jìn)展的關(guān)鍵因素。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一高度保守的應(yīng)激蛋白家族，廣泛存在于原核細(xì)胞和真核

2、細(xì)胞中。HSP70是熱休克蛋白家族中最重要的成員，其基本功能是參與新生蛋白質(zhì)的折疊、解聚、移位等，故有“分子伴侶”(molecular chaperone)之稱。長期以來，熱休克蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，只能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，HSP70能被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，稱為細(xì)胞外HSP70(extracellular HSP70)；而且細(xì)胞外HSP70可能作為免疫系統(tǒng)的“危險(xiǎn)信號”，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，參與免疫性疾病的病理過程。近

3、年來研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)液中HSP70水平明顯升高。然而，RA關(guān)節(jié)液和血清中HSP70與RA活動性之間相關(guān)性如何?關(guān)節(jié)液中HSP70的來源和釋放機(jī)制是什么?細(xì)胞外HSP70對RA炎癥是否有影響?目前尚無相關(guān)研究。 本研究首先觀察了RA患者血清和關(guān)節(jié)液中HSP70水平的改變及其臨床意義；然后探討熱應(yīng)激和TNF-α對細(xì)胞外HSP70釋放的影響及其機(jī)制；并從整體動物水平和細(xì)胞水平探討細(xì)胞外HSP70對RA的作用及其機(jī)制。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果如下： 1、RA患者血清和關(guān)節(jié)液中HSP70的改變及臨床意義。 (1)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清中HSP70含量變化：RA患者血清中HSP70含量(2.84±1.16 ng/ml)明顯高于骨關(guān)節(jié)炎(OA)(0.74±0.34 ng/ml)和正常對照組(0.84±0.42 ng/ml)，并且活動期RA血清中HSP70含量(3.31±1.09 ng/ml)明顯高于非活動期RA(1.89±0.06 ng/ml)；RA患者血

5、清中HSP70水平與腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6水平呈正相關(guān)；RA患者血清HSP70的水平與血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)呈正相關(guān)。(2)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者關(guān)節(jié)液中HSP70含量變化：RA患者關(guān)節(jié)液中HSP70含量(88.97±21.49 ng/ml)明顯高于OA組(33.13±17.27 ng/ml)，并且活動期RA(102.55±19.61 ng/ml)明顯高于非活動期RA(80.

6、36±10.88 ng/ml)；RA患者血清HSP70水平與TNF-α、IL-6、IL-10水平呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示細(xì)胞外HSP70產(chǎn)生可能與RA炎癥刺激有關(guān)，也提示細(xì)胞外HSP70可能參與RA的炎癥過程，細(xì)胞外HSP70水平可以考慮作為RA患者的病情活動指標(biāo)。 2、應(yīng)激對成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70釋放的影響。 (1)熱應(yīng)激對HSP70釋放的影響：成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte

7、s，F(xiàn)LSs)遭受不同溫度的熱休克(heat shock，HS)時，細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)和細(xì)胞外HSP70釋放都明顯增加；重度HS引起HSP70釋放增多同時伴有乳酸脫氫酶(LDH)釋放增多；輕度HS也能誘導(dǎo)HSP70釋放，卻沒有明顯LDH釋放。(2)炎癥應(yīng)激對HSP70釋放的影響：TNF-α能劑量和時間依賴性誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70的表達(dá)和釋放增多，但是LDH釋放并沒有明顯增多。這提示多種應(yīng)激可導(dǎo)致HSP70的主動釋放。(3)脂筏

8、在HSP70主動釋放中的作用：脂筏結(jié)構(gòu)的破壞劑β甲基環(huán)狀糊精(methyl-β-cyclodextrin，MβD)處理成纖維樣滑膜細(xì)胞后能上調(diào)熱休克和TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)水平，同時MβD能劑量依賴性抑制熱休克或TNF-α所致成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70的主動釋放。以上研究表明，各種應(yīng)激刺激，包括TNF-α能促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70的表達(dá)和主動釋放，而脂筏與成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70的主動釋放有關(guān)。 3、HSP

9、70對成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子分泌的影響及機(jī)制。 (1)細(xì)胞外HSP70對成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子分泌的影響：本研究用重組的人HSP70處理成纖維樣滑膜細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70單獨(dú)處理不能影響促炎因子IL-6、IL-8和巨噬細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1的分泌，但能劑量依賴性抑制TNF-α所致成纖維樣滑膜細(xì)胞中IL-6、IL-8和MCP-1的分泌；HSP70能劑量和時間依賴性直接誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-10的生成；煮沸(100

10、℃)能消除HSP70對細(xì)胞因子分泌的影響，而多粘菌素B(polymyxin B，PMB)不能消除HSP70對細(xì)胞因子分泌的影響。以上結(jié)果表明細(xì)胞外HSP70通過抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞促炎因子分泌和促進(jìn)抗炎因子分泌而發(fā)揮抗炎作用，而且細(xì)胞外HSP70對細(xì)胞因子分泌的影響與內(nèi)毒素污染無關(guān)。 (2)HSP70作用于成纖維樣滑膜細(xì)胞的受體類型：本研究首先通過RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Toll樣受體(toll-

11、likerecepfor，TLR)2和TLR4在成纖維樣滑膜細(xì)胞中的表達(dá)；采用專一針對抗TLR2或TLR4的單克隆抗體封閉成纖維樣滑膜細(xì)胞膜上TLR2或TLR4，發(fā)現(xiàn)抗TLR4抗體預(yù)處理廢除了HSP70對促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、MCP-1和抗炎細(xì)胞因子IL-10分泌的影響，而抗TLR2抗體預(yù)處理卻不能廢除HSP70對上述細(xì)胞因子分泌的影響。以上結(jié)果表明細(xì)胞外HSP70對成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥因子分泌的影響是TLR4依賴性的，即成纖

12、維樣滑膜細(xì)胞表面TLR4可能是細(xì)胞外HSP70的受體。 (3)HSP70對炎癥信號通路的影響：重組的人HSP70能夠顯著抑制TNF-a所致JNK、ERK、p38 MAPK的活化；HSP70能夠抑制TNF-a所致IκB的降解和NF-κB p65的核移位；HSP70也能夠直接誘導(dǎo)STAT3的活化和SOCS3的表達(dá)。上述研究表明，細(xì)胞外HSP70通過抑制MAPK、NF-κB通路的活化及激活JAK-STAT3-SOCS3通路來調(diào)節(jié)炎癥細(xì)

13、胞因子分泌。 4、HSP70對膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)動物模型的影響。本研究首先應(yīng)用基因工程技術(shù)制備重組的人HSP70，然后在小鼠初次免疫膠原后的第28天出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎時給予重組HSP70腹腔注射。結(jié)果顯示，HSP70能夠減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹和降低關(guān)節(jié)炎評分；組織病理學(xué)檢查顯示HSP70能夠減少滑膜組織炎癥細(xì)胞滲出和骨質(zhì)破壞。此外，HSP70明顯降低CIA小鼠血清中TNF-α和I

14、L-6水平。上述研究表明細(xì)胞外HSP70能夠緩解小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的炎癥，對RA具有治療作用。 綜上所述，RA患者血清和關(guān)節(jié)液中HSP70水平明顯升高，并且與RA疾病活動性和炎癥細(xì)胞因子之間存在相關(guān)性，提示細(xì)胞外HSP70產(chǎn)生可能與RA炎癥刺激有關(guān)，細(xì)胞外HSP70水平可作為RA疾病活動性的參考指標(biāo)；熱休克或TNF-α誘導(dǎo)了成纖維樣滑膜細(xì)胞HSP70的主動釋放，而且HSP70的主動釋放與成纖維樣滑膜細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)有關(guān)，提示RA

15、患者關(guān)節(jié)液中高水平的HSP70可能來源于成纖維樣滑膜細(xì)胞受應(yīng)激刺激后的主動分泌；重組人HSP70通過抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞促炎因子IL-6、IL-8和MCP-1的分泌和促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10分泌來發(fā)揮抗炎作用；HSP70對細(xì)胞因子分泌的影響具有TLR4依賴性，提示成纖維樣滑膜細(xì)胞表面的TLR4可能是HSP70作用的受體；HSP70通過抑制MAPK、NF-κB通路和激活JAK-STAT3-SOCS3通路來調(diào)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥因子的分