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文檔簡介
1、研究目的:
炎癥是一種生存必需的基礎(chǔ)生理過程,但它同時又是人類疾病的一大誘因。近期的研究表明迷走神經(jīng)能夠通過膽堿能抗炎通路來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),抑制炎癥。乙酰膽堿是迷走神經(jīng)的重要神經(jīng)遞質(zhì),它能夠通過α7煙堿型尼古丁乙酰膽堿受體(α7-nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的釋放。
尼古丁作為一種選擇性更高的激動劑,可以更有效的抑制炎癥因子的產(chǎn)生。已有
2、越來越多的研究證明α7nAChR在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,但是α7nAChR 激活后的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻并未被研究透徹。α7nAChR 激動劑尼古丁和乙酰膽堿能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放,但是卻不影響這些炎癥因子的mRNA水平,提示我們尼古丁的抑炎作用,發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平。而我們知道m(xù)iRNA 這樣一種內(nèi)源性的小分子非編碼RNA對靶mRNA的抑制作用也發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。
因此我們設(shè)想:miRNAs 可能在膽堿能抗
3、炎中扮演了重要的角色,本課題的研究目的在于探討是否存在作用于膽堿能抗炎通路的miRNAs,并對其作用機(jī)制及加強(qiáng)膽堿能抗炎的療效進(jìn)行觀察。
研究方法:
本研究以內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥為主要模型,在整體動物和巨噬細(xì)胞模型上,利用整體動物學(xué)實驗方法和分子生物學(xué)手段,研究參與膽堿能抗炎過程的miRNAs (已經(jīng)篩選出miR-124a作為研究對象)。在細(xì)胞水平上,研究miR-124a對炎癥因子IL-6與TNF-α表達(dá)的影響;在
4、動物整體水平上,通過研究miR-124a 過表達(dá)以及缺失情況下對炎性休克的影響,進(jìn)一步證實miR-124a的抗炎作用;并使用分子生物學(xué)手段初步探討miR-124a抗炎作用的機(jī)制。
結(jié)果:
1.在RAW264.7 巨噬細(xì)胞建立尼古丁抗炎模型,發(fā)現(xiàn)尼古丁抗炎特點——降低IL-6蛋白水平與mRNA水平的表達(dá),僅降低TNF-α蛋白水平的表達(dá)卻不影響TNF-αmRNA水平的表達(dá);尼古丁激活α7nAChR后能夠明顯上調(diào)使
5、miR-124a的表達(dá)量;通過時效實驗我們觀察到,尼古丁作用后3h,miR-124a表達(dá)開始上調(diào),早于尼古丁對炎癥因子IL-6與TNF-?的抑制作用;而miR-124a 過表達(dá)可以劑量依賴的降低IL-6與TNF-α的蛋白水平,也可劑量依賴的下調(diào)IL-6mRNA水平,但是不影響TNF-α的mRNA水平,與尼古丁抗炎的特點相符;
miR-124a knockdown后可以觀察到尼古丁對IL-6與TNF-?蛋白水平的抑制作用均有
6、減弱,但是僅減弱尼古丁對IL-6 mRNA的抑制而不影響TNF-α的水平。
2.在動物整體水平,我們摸索了內(nèi)毒素致Blab/c小鼠感染性休克的劑量與尼古丁的有效抗休克劑量;并觀察到尼古丁抗炎時,小鼠心、脾、腦與血清中miR-124a的表達(dá)均有明顯的上調(diào);而在整體水平使miR-124a 過表達(dá)可以顯著延長內(nèi)毒素血癥小鼠的生存時間;miR-124a 整體水平knockdown后尼古丁抗休克作用減弱。
3.熒光素酶
7、報告基因結(jié)果證明miR-124a不能直接作用于IL-6和TNF-??mRNA的3’-UTR, 但是可以直接作用于STAT3 mRNA的3’-UTR;在RAW細(xì)胞中miR-124a 過表達(dá)能夠抑制STAT3蛋白表達(dá),而且能夠通過抑制STAT3蛋白表達(dá)而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的STAT3 磷酸化增加;通過觀察尼古丁對STAT3與p-STAT3蛋白表達(dá)時效影響,發(fā)現(xiàn)LPS作用3h后p-STAT3表達(dá)顯著上調(diào),而尼古丁能夠降低STAT3蛋白表達(dá)及其磷酸
8、化,而不影響STAT3 mRNA的水平,說明尼古丁對STAT3的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平;STAT3 knockdown 使LPS 誘導(dǎo)的IL-6的蛋白水平與mRNA的水平均被抑制,而對TNF-?蛋白水平和mRNA水平均無影響;STAT3 knockouT細(xì)胞中LPS 誘導(dǎo)炎癥后IL-6蛋白和mRNA水平明顯降低,但上清TNF-α蛋白水平未能檢出。STAT3 knockdown后miR-124a抑制IL-6蛋白的作用減弱,而不影響TNF-α
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