鼻咽癌發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因篩選及Annexin A6基因在鼻咽癌中的表達(dá)研究.pdf

1、目的:首先以永生化的鼻咽上皮細(xì)胞株(NP69)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)細(xì)胞株(6-10B、5-8F)為研究模型，從蛋白表達(dá)譜入手，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選NPC中發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因。而后從發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因中選取Annexin A6（ANXA6）為研究對(duì)象，檢測(cè)ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細(xì)胞株中的甲基化情況，初步闡明ANXA6在NPC中表達(dá)下調(diào)的部分機(jī)制以及在NPC中的作用。

2、
　　方法:培養(yǎng)永生化的鼻咽上皮細(xì)胞NP69和NPC細(xì)胞6-10B、5-8F，分別抽提蛋白質(zhì)，測(cè)量蛋白濃度，采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)的方法分離鑒定三株細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。通過(guò)ProteinPilotTM4.2軟件進(jìn)行Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)

3、搜索及鑒定，從中篩選出6-10B和5-8F兩株NPC細(xì)胞相對(duì)NP69表達(dá)都下調(diào)的差異蛋白，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。進(jìn)一步挑選ANXA6基因采用qRT-PCR(Quantitative Reversetranscriptase Polymerase chain reaction)檢測(cè)5-8F、6-10B和NP69中mRNA的表達(dá)水平;采用蛋白印跡法(Western Blotting)驗(yàn)證ANXA6蛋白在5-8F、6-10B和NP69三株細(xì)胞

4、中的表達(dá)水平;采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)ANXA6蛋白在NPC組織和鼻咽上皮組織中的表達(dá)情況，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析NPC中ANXA6蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系;采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69細(xì)胞株中的甲基化情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:根據(jù)篩選條件，篩選出兩株NPC細(xì)胞相對(duì)NP69低表達(dá)的差異蛋白98個(gè)，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白通過(guò)多種信號(hào)通路在鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)

5、揮作用。挑選ANXA6進(jìn)一步研究，qPCR和Western blotting結(jié)果顯示mRNA和蛋白表達(dá)情況與iTRAQ的結(jié)果一致:NP69表達(dá)高于6-10B，6-10B表達(dá)高于5-8F，兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ANXA6在NPC組織中表達(dá)低于鼻咽上皮組織(P＜0.001)，且ANXA6蛋白表達(dá)水平與NPC的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān);亞硫酸氫鹽修飾后基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)NP69細(xì)胞ANXA6基因無(wú)甲基化，而6-10B和

6、5-8F存在不同程度的甲基化，其甲基化百分比分別為25.6％、17.9％，NP69與6-10B和5-8F比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而6-10B與5-8F比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1、本研究以NPC細(xì)胞株5-8F、6-10B和永生化的鼻咽上皮細(xì)胞株NP69為研究模型，采用iTARQ結(jié)合2DLC-MS/MS的方法篩選出NPC發(fā)生相關(guān)下調(diào)基因98個(gè)。
　　2、ANXA6蛋白在細(xì)胞NP69、6-10B、5-8F中表達(dá)依次下降，且

7、鼻咽上皮組織、未轉(zhuǎn)移NPC組織、轉(zhuǎn)移NPC組織表達(dá)依次下降。據(jù)此推測(cè)，ANXA6蛋白表達(dá)下調(diào)可能與NPC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　3、ANXA6表達(dá)下調(diào)/缺失與NPC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，ANXA6表達(dá)下調(diào)/缺失的NPC更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期更晚。
　　4、在NPC中ANXA6基因甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)/缺失的重要原因之一，同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平還有其他的機(jī)制參與調(diào)控ANXA6的表達(dá)。
　　5、