鼻咽癌相關(guān)新基因LOC344967的功能研究.pdf

1、研究背景與目的：惡性腫瘤越來(lái)越成為人類的殺手，給世界尤其是發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO公布，目前約有2千5百萬(wàn)腫瘤患者，每年新增病例達(dá)1千萬(wàn)左右，到2020年將達(dá)到3千萬(wàn)患者，新增病例達(dá)每年1千6百萬(wàn)，且每年將有1千萬(wàn)人死于腫瘤疾病。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是來(lái)源于人類鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其病因涉及遺傳因素、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染和化學(xué)致癌物作用，是

2、一種經(jīng)典的復(fù)雜性狀疾病。鼻咽癌在世界范圍少見，但在中國(guó)南方、東南亞和北非的部分國(guó)家非常常見。
　　 目前對(duì)導(dǎo)致鼻咽癌的基因研究仍未有突破性進(jìn)展，一般認(rèn)為鼻咽癌是遺傳因素，EB病毒和環(huán)境因素及其相互作用的結(jié)果。因此鼻咽癌是研究“基因一環(huán)境一病毒”相互作用導(dǎo)致癌癥病理發(fā)生的一個(gè)極具代表性的模型。1975年，SimonsMJ報(bào)道了人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)基因座和鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，許多

3、后來(lái)的研究也肯定了這一發(fā)現(xiàn)[1]。Lu SJ等開展了受累同胞對(duì)連鎖分析，他們的研究結(jié)果表明HLA區(qū)域可能存在與鼻咽癌相關(guān)的易感基因。在易感基因定位方面除了發(fā)現(xiàn)HLA位點(diǎn)或者其單體型與鼻咽癌有關(guān)外，湖南一個(gè)研究小組運(yùn)用鼻咽癌家系標(biāo)本將易感位點(diǎn)定位在染色體3p21上。同時(shí)，在對(duì)候選基因的關(guān)聯(lián)研究中，相關(guān)聯(lián)的多態(tài)位點(diǎn)還有T細(xì)胞受體TCR(T cellreceptor)基因，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTM I(Glutathione S-Transfe

4、rase M1)基因，細(xì)胞色素氧化酶P4502E1基因，多聚免疫球蛋白受體PIGR(Polyimmunoglobulinreceptor)基因。熱休克蛋白HSP70-2和DNA修復(fù)酶基因XRCC1(X-ray repaircross-complementing group1)，hOGG1(human8-Oxoguanine DNA Glycosylase)以及其他的一些基因也被報(bào)道和鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這些研究結(jié)果提示可能很多基因參與

5、了鼻咽癌發(fā)生不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或細(xì)胞功能的活化，它們的協(xié)同作用導(dǎo)致了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，而這與腫瘤的多因素遺傳模式是吻合的。
　　 對(duì)于鼻咽癌的家族聚集性已經(jīng)有許多文章報(bào)道，在以前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，在2,252個(gè)先證者組成的家系中，與其他方言相比，在操?gòu)V東話的家系中鼻咽癌呈現(xiàn)更明顯的家族聚集現(xiàn)象。針對(duì)32個(gè)廣東鼻咽癌家系運(yùn)用全基因組連鎖分析，我們把鼻咽癌的易感區(qū)域定位在染色體4p15.1-q12。后來(lái)，加進(jìn)更多的微衛(wèi)星標(biāo)記和單核苷

6、酸多態(tài)性標(biāo)記，并對(duì)該區(qū)域的基因進(jìn)行篩選，目標(biāo)集中在外顯子，啟動(dòng)子和外顯子-內(nèi)含子的交界處。我們發(fā)現(xiàn)一新基因LOC344967的上游調(diào)節(jié)區(qū)攜帶的一個(gè)SNP位點(diǎn)-32G/A，在我們研究的31、34、62和43號(hào)核心家系中和疾病表型共分離。我們基于前期大量遺傳學(xué)分析認(rèn)為L(zhǎng)OC344967基因可能與鼻咽癌發(fā)病高度相關(guān)。
　　 盡管其生物學(xué)功能仍未明確，RT-PCR結(jié)果顯示在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種癌組織和鼻咽癌細(xì)胞系中都檢測(cè)到它轉(zhuǎn)錄水平的表

7、達(dá)。LOC344967基因廣泛的組織分布說(shuō)明它可能具有重要的生物學(xué)功能。生物信息學(xué)分析顯示LOC344967可能屬于硫酯酶超家族，與人BACH蛋白高度同源。
　　 硫酯酶在從低等到高等生物中具有高度的進(jìn)化保守性，在不同組織都具有廣泛的活性。真核生物中包括溶酶體，過(guò)氧化物酶體，線粒體及胞質(zhì)中都能檢測(cè)到硫酯酶活性。至今為止，許多硫酯酶的功能并不非常明確，一般認(rèn)為它對(duì)脂肪代謝起到調(diào)控作用，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與細(xì)胞內(nèi)吞作用。硫酯酶

8、還調(diào)節(jié)了某些蛋白的?；癄顟B(tài)，包括信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及細(xì)胞內(nèi)定位。硫酯酶II還可作為兔乳腺癌發(fā)生和人類腫瘤中乳腺來(lái)源的標(biāo)記[13，14]。Liu，L.X報(bào)道硫酯酶可調(diào)節(jié)HIV病毒的Nef誘導(dǎo)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞下調(diào)[15]。某些硫酯酶的表達(dá)異常有可能導(dǎo)致細(xì)胞及組織的異常筋攣和增殖，從而引發(fā)各種相關(guān)疾病，如炎癥，免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤的發(fā)生。
　　 脂肪酸代謝是動(dòng)植物中廣泛存在的生理過(guò)程。脂肪酸參與細(xì)胞內(nèi)能量的儲(chǔ)存、胞膜的組成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)

9、、蛋白質(zhì)?；饔谩⒓?xì)胞極化和遷移等重要過(guò)程。大量臨床、基礎(chǔ)研究表明腫瘤具有獨(dú)立的合成脂肪酸進(jìn)行能量補(bǔ)充、胞膜磷脂合成的能力，而且這種合成似乎并不依賴存在于正常細(xì)胞中的可調(diào)節(jié)脂肪酸合成的調(diào)節(jié)信號(hào)。腫瘤的內(nèi)源性脂肪酸合成為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了極其重要的脂肪酸來(lái)源。
　　 因而，我們?cè)贚OC344967與硫酯酶活性、脂肪酸代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系上做更深入的研究。
　　 方法：通過(guò)RT-PCR方法從鼻咽上皮細(xì)胞系NP69中擴(kuò)

10、增LOC344967及hBACHa的cDNA序列，插入各種單獨(dú)表達(dá)或融合表達(dá)的表達(dá)載體。體外瞬時(shí)表達(dá)后，檢測(cè)細(xì)胞的硫酯酶活性及各項(xiàng)與細(xì)胞增殖相關(guān)參數(shù)；檢測(cè)LOC344967瞬時(shí)表達(dá)后脂肪酸組成改變，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)產(chǎn)生水平及細(xì)胞ATP水平的變化。
　　 構(gòu)建LOC344967轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察該轉(zhuǎn)基因小鼠的表型及各器官表達(dá)情況，及各器官的脂肪酸組成。通過(guò)小鼠尾靜脈注射B16小鼠黑色素

11、腫瘤細(xì)胞，觀察B16細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因小鼠肺中的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移情況及其與野生型小鼠的區(qū)別。
　　 結(jié)果：通過(guò)全細(xì)胞酶活檢測(cè)，我們證實(shí)LOC344967雖然與硫酯酶hBACHa高度同源，但由于在N端存在缺失，導(dǎo)致硫酯酶活性的喪失。有意思的是，LOC344967可以通過(guò)誘導(dǎo)hBACH的降解，抑制內(nèi)源性硫酯酶活性的作用，從而上調(diào)Acyl-CoA水平，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞ATP水平上升，活性氧ROS濃度升高。
　　 相反，通過(guò)hBACHa的過(guò)表達(dá)

12、則導(dǎo)致ATP水平下調(diào)及活性氧ROS濃度降低。相應(yīng)的MTT實(shí)驗(yàn)及流式結(jié)果證明了F/LOC能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而hBACHa則抑制細(xì)胞增殖。
　　 同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)F/LOC在細(xì)胞中高表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞總脂肪酸中c9，t11和t10，c12兩種共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)亞型含量顯著上升。這種功能性脂肪酸可以通過(guò)上調(diào)活性氧的水平，促使細(xì)胞自噬的發(fā)生，這也可能是促進(jìn)細(xì)胞ATP水平上升的機(jī)制之一。

13、>　　 在轉(zhuǎn)基因小鼠中，F(xiàn)/LOC主要表達(dá)于腎和肺中，并導(dǎo)致這些組織中c9，t11和t10，c12兩種亞型的共軛亞油酸(CLAs)含量顯著升高：在尾靜脈注射B16腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，在F/LOC轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠的肺中形成的轉(zhuǎn)移灶明顯比野生型小鼠少，提示了CLAs的升高可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　 結(jié)論：我們首次證明了LOC344967編碼的蛋白具有抑制細(xì)胞內(nèi)硫酯酶活性的功能，并能改變脂肪酸的組成，明顯升高共軛亞油酸