Lis1-Dynein通路上中心體相關(guān)蛋白NudCL和Twa1的功能研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)Dynein是一類能與微管結(jié)合馬達(dá)蛋白，是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕?qū)動力之一。目前有證據(jù)顯示無腦回綜合癥致病基因Lisl（Lissencephaly1）可能參與了Dynein運(yùn)動能力的調(diào)節(jié)。在曲霉菌中，細(xì)胞核分布基因nudC（nuclear distribuTiO2gene C）可能是Lisl的同源基因nudF（nuclear distribuTiO2 gene F)的上游基因，nudC突變將極大降低NudF的蛋白水平。這樣，NudC

2、、Lisl和Dynein（其重鏈?zhǔn)羌?xì)胞核分布基因nudA的同源基因）等組成了一條從曲霉菌到哺乳類進(jìn)化上非常保守的調(diào)節(jié)通路。
　　 在哺乳動物中，Lisl/Dynein通路更加復(fù)雜化和網(wǎng)絡(luò)化。NudC和Lisl各自存在其同源物，協(xié)同這兩個蛋白共同發(fā)揮作用。這些蛋白和Dynein形成巨大的復(fù)合物，共同參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控。同時，這條通路上的蛋白大都定位于中心體或沿著微管分布。而中心體作為微管組織中心影響了細(xì)胞

3、內(nèi)絕大多數(shù)與微管相關(guān)的過程，包括細(xì)胞有絲分裂、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞遷移。因此，Lisl/Dynein通路的重要性越來越被人們所廣泛認(rèn)識。但是，目前在這條通路中還有一些成員沒有被發(fā)現(xiàn)，而且已發(fā)現(xiàn)的蛋白之間的相互作用的具體機(jī)制也并不完全清楚。近年來我們實(shí)驗室一直從事這條通路上新成員的鑒定以及相互調(diào)控機(jī)制的研究。在這里我們重點(diǎn)研究了Lisl/Dynein通路中的兩個新成員：NudC同源蛋白NudCL（Nuclear distribu

4、TiO2 gene C Like)和Lisl相關(guān)蛋白Twal（Two hybrid associated protein No.1 with RanBPM），并首次觀察到了這兩個蛋白都定位于中心體上。為了進(jìn)一步明確NudCL和Twal的生物學(xué)功能，闡明Lisl/Dynein通路的分子調(diào)控機(jī)制，我們從細(xì)胞水平和模式動物胚胎發(fā)育的角度來系統(tǒng)研究這兩個蛋白的功能。
　　 第一部分：中心體相關(guān)蛋白NudCL在細(xì)胞胞質(zhì)分裂及細(xì)胞增殖中的作

5、用
　　 我們實(shí)驗室先前的工作發(fā)現(xiàn)NudCL在高爾基體上有定位，并能通過調(diào)節(jié)Dynein中間鏈（Dynein Intermediate Chain，DIC）的穩(wěn)定性影響細(xì)胞有絲分裂的正常進(jìn)行。這里，我們通過免疫熒光實(shí)驗發(fā)現(xiàn)NudCL蛋白在細(xì)胞間期定位于中心體上，在有絲分裂中期富集在紡錘體的雙極（spindle poles），在胞質(zhì)分裂期則集中到中體部位（midbody）。細(xì)胞計數(shù)和MTT實(shí)驗顯示在哺乳類細(xì)胞中過量表達(dá)NudCL可

6、以抑制細(xì)胞增殖。免疫熒光實(shí)驗發(fā)現(xiàn)NudCL過量表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。實(shí)時顯微攝影技術(shù)結(jié)合免疫熒光技術(shù)顯示，過量表達(dá)NudCL后大部分多核細(xì)胞的胞質(zhì)分裂出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為中體處微管結(jié)構(gòu)的紊亂或中體環(huán)的消失。此外，NudCL過量表達(dá)還能引起細(xì)胞有絲分裂期時間延長，多極紡錘體的出現(xiàn)和染色體分向兩極的滯后等一些有絲分裂過程中的異?，F(xiàn)象。通過RNAi實(shí)驗降低NudCL的表達(dá)水平我們還發(fā)現(xiàn)除了之前已經(jīng)報道的導(dǎo)致有絲分裂中期染色體排列異常、出

7、現(xiàn)啞鈴形細(xì)胞核、導(dǎo)致細(xì)胞死亡等一些現(xiàn)象以外，在一些越過M期阻滯的細(xì)胞中也出現(xiàn)胞質(zhì)分裂的異常。這些結(jié)果提示NudCL可能除了前期發(fā)現(xiàn)的在有絲分裂中期的作用外，在胞質(zhì)分裂期對中體結(jié)構(gòu)的正確形成和兩個子代細(xì)胞之間連接的剪斷可能都有重要的意義。
　　 第二部分：中心體相關(guān)蛋白Twal在細(xì)胞遷移和胚胎發(fā)育中的作用
　　 無腦回綜合癥致病基因Lisl是一個在神經(jīng)細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和存活等過程中扮演重要角色的基因。在小鼠中剔除Lisl

8、基因，小鼠在胚胎發(fā)育早期即死亡。人類的Lisl基因突變會導(dǎo)致I型無腦回綜合癥（Lissencephaly），患者大腦皮層平滑，智力低下，壽命短，常有癲癇發(fā)作。然而，至今為止尚無LIS1家族成員的報道。我們通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了在進(jìn)化上高度保守的Twal是一個具有Lisl同源結(jié)構(gòu)域（LisH結(jié)構(gòu)域）和LisH羧基端結(jié)構(gòu)域（CTLH結(jié)構(gòu)域）蛋白質(zhì)。已有報道表明Twal在細(xì)胞核中有定位，并能和RanBPM（Ran-binding prot

9、ein M）和Muskelin相互作用，但其功能一直不明。我們的研究發(fā)現(xiàn)Twal除了定位于細(xì)胞核里外，在中心體上也有明顯定位，能在體內(nèi)與Lisl/Dynein相結(jié)合。愈傷實(shí)驗和Transwell實(shí)驗顯示，在細(xì)胞中降低Twal的蛋白水平會導(dǎo)致細(xì)胞遷移受阻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Twal被降調(diào)的細(xì)胞在了leading edge處的Dynein分布缺失。此外過量表達(dá)缺失LisH功能結(jié)構(gòu)域的Twal突變體也會導(dǎo)致細(xì)胞遷移受阻。RT-PCR半定量分析和原

10、位雜交顯示，在爪蟾胚胎發(fā)育過程中Twal在原腸形成時期（第10-13期）和器官形成時期（第19-30期）表達(dá)量較高；并且其表達(dá)主要集中在胚胎頭部，特別是眼部和腦部。在爪蟾胚胎中顯微注射缺失LisH功能結(jié)構(gòu)域的Twal突變體質(zhì)粒會導(dǎo)致胚胎頭部發(fā)育嚴(yán)重畸形，嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。這些結(jié)果提示Twal可能與Lisl有部分類似的功能，能參與細(xì)胞遷移過程，并在胚胎早期發(fā)育，特別是腦和眼部發(fā)育中起重要作用。
　　 以上研究表明，Lisl/Dyn